[发明专利]一种检测蛋白制品游离手性氨基酸指纹图谱的高效液相色谱法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测蛋白制品游离手性氨基酸指纹图谱的高效液相色谱法及其应用。首先从蛋白类制品中提取游离氨基酸，利用Nα‑(2,4‑二硝基‑5‑氟苯基)‑L氨基丙酰胺进行柱前衍生化处理，通过配备AcclaimC18色谱柱的高效液相色谱‑紫外检测器进行分离检测，最后经标准曲线计算出各氨基酸含量。在该方法中，衍生产物在15小时内具有良好稳定性；单个样品分析时间为75分钟；弥补了目前此类方法设备成本高昂、衍生化产物稳定性低、单个样品检测时间较长的缺陷；实现了对蛋白类制品游离手性氨基酸指纹图谱的定性和定量表征，为研究食源性D型氨基酸的营养代谢及生理功能等方面的研究提供关键信息。

技术领域

本发明属于手性氨基酸检测技术领域，具体涉及一种检测蛋白制品游离手性氨基酸指纹图谱的高效液相色谱法及其应用。

背景技术

α-碳作为氨基酸的立体中心以连接着氨基、羧基、氢原子和侧链基团，在组成蛋白质的氨基酸中，除甘氨酸外其余氨基酸均具有手性α-碳原子而使其各自均具备两个互为镜像的立体异构体(D型氨基酸和L型氨基酸)。长期以来，在蛋白质氨基酸的相关研究中主要的讨论对象为L型氨基酸，而近年来逐渐有越来越多的研究关注到D型氨基酸。研究表明，手性氨基酸在自然界中广泛存在，尤其在蛋白类制品中丰度相对较高。例如，酸奶中D型氨基酸含量可高达53.8％(D-丙氨酸)、40.3％(D-天冬氨酸)和24.2％(D-谷氨酸)。特定的D型氨基酸还具备调节神经信号传导、激素分泌、细菌生物膜形成、免疫系统活动等功能。因此，D型氨基酸的检测可为控制加工蛋白类制品品质、研究食源性D型氨基酸的营养代谢及生理功能等方面的研究提供关键的信息。

现有检测手性氨基酸的方法中主要以高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法为主、此外仍有气相色谱-质谱法、毛细管电泳法和传感器法等。

KONYA等报道了建立了一套基于高效液相色谱结合手性柱和飞行时间质谱的方法检测酸奶中的D型氨基酸含量(Konya Y,Taniguchi M,Fukusaki E.Novel high-throughput and widely-targeted liquid chromatography-time of flight massspectrometry method for d-amino acids in foods[J].Journal of bioscience andbioengineering,2017,123(1):126-133.)。该方法的不足之处在于：其利用的手性柱相对于普通的C18柱而言成本较高，以及需要连用质谱仪进行检测，整体检测成本相对高昂。

中国专利申请乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法公开了基于柱前衍生化方法通过配备荧光检测器的高效液相色谱仪对乳基料中35种游离手性氨基酸进行检测。该方法的不足之处在于：1)稳定性较差，其通过N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛衍生的待测产物在室温下稳定存在的时间仅为1.5-18min，因而在测定批量样品时需要连续繁琐地进行衍生化处理，这有可能造成样品批次间数据不稳定的缺陷。2)设备成本较高，基于N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛衍生的方法需要借助配备荧光检测器的高效液相色谱仪才能进行检测。3)单个样品检测时间较长，其测定一个样品的液相运行程序时间需90分钟。

因此，在现有技术公开的利用高效液相色谱法测定蛋白类制品游离手性氨基酸的方法中，存在设备成本高昂、衍生化产物稳定性低和单个样品检测时间较长的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有测定手性氨基酸方法所存在的设备成本高、衍生化产物稳定性第及检测时间较长，从而难以满足快速高效地对手性氨基酸进行定性及定量分析的局限性，提供一种检测蛋白制品游离手性氨基酸指纹图谱的高效液相色谱法及其应用。