[发明专利]一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法

权利要求书

1.一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.如权利要求1所述一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的初级转录本，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：取接菌48h后叶片和未接菌叶片，先分别在RNase浸泡15min，然后用pH 7.4的1×PBS洗涤3次；

S2：将经S1处理的叶片样品放置于4％多聚甲醛真空浸润15min，至样品下沉，变成半透明状，然后放到4℃冰箱过夜；

S3：所有样品用1×PBS冲洗3次，每次间隔5min；

S4：经S3处理的样品放置于添加20μg/mL蛋白酶K和0.5％Triton-X的TE缓冲液中37℃处理2-3h，以消化细胞内多余的RNA酶和蛋白质，并渗透细胞以进入探针；

S5：经S4处理的样品在pH 7.4的1x PBS中冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟；

S6：在室温下用0.2％甘氨酸浸泡5分钟，以停止蛋白酶活性；

S7：经S6甘氨酸处理后，样品用4％多聚甲醛固定5分钟，再次在1x PBS缓冲液中冲洗；

S8：将LNA和FAM修饰后的探针在50％甲酰胺中85℃变性3min，然后立即冰浴5min；

S9：将经S8获得的20μL浓度为35μM的探针溶液和作为无探针对照的20μL的50％甲酰胺，分别连同80μL的杂交缓冲液加入到装有经S7处理样品的样品管中，50℃，300rpm过夜孵育；

S10：将0.2×SSC缓冲液加入经S9处理的样品管中，50℃，300rpm清洗30min，上述清洗重复一次；

S11：将包含0.1％碘化丙啶的0.2×SSC缓冲液加入经S10处理的样品管中，37℃，300rpm清洗5min；

S12：将包含0.1％碘化丙啶的0.2×SSC缓冲液加入经S11处理的样品管中，室温，300rpm清洗5min；

S13：用0.2×SSC缓冲液漂洗经S12处理的样品，去色。

4.如权利要求3所述的一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，所述的经LNA和FAM修饰后的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种如权利要求1所述一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的靶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为包含权利要求1所述一种检测斑点落叶病感病叶片跨界传递致病的milRNA的pFGC5941载体。

7.一种工程菌，其特征在于，包含权利要求6所述的植物表达载体。

8.一种植物表达载体，其特征在于，包含权利要求5所述的靶基因的pFGC5941载体。

9.一种工程菌，其特征在于，包含权利要求8所述的植物表达载体。

10.一种提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：通过CTAB方法提取感病苹果总RNA；

S2：将经S1提取的总RNA逆转录成cDNA；

S3：利用S2得到的逆转录的模板和RT-PCR引物克隆权利要求5所述的靶基因；

S4：将S3得到的靶基因插入pFGC5941载体上的BamHI和NcoI两个酶切位点中，转入大肠杆菌DH5α中；

S5：将经S4构建的过表达靶基因载体提取质粒；

S6：将S5提取的质粒转入农杆菌中，涂布于加有抗生素的固体YEP培养基上，将平板于28℃倒置培养24-48h；上述抗生素包含50mg/L Kana，20mg/L RifS7：经S6培养的农杆菌挑取单斑，加入包含50mg/L Kana，20mg/L Rif的YEP液体培养基2ml，28℃，180rpm培养过夜；

S8：取80μL经S7培养的农杆菌菌液，加入包含50mg/L Kana，20mg/L Rif及10μM乙酰丁香酮的YEP液体培养基4ml，28℃，180rpm培养12-16h；

S9：将经S8培养的农杆菌菌液室温10000rpm离心1min，除去培养基；用1-2ml悬浊液经涡旋震荡悬浮上述菌液；取经震荡悬浮的菌液10μL加入990μL悬浊液得菌体悬浊液，用分光光度计测定其OD600，将菌体悬浊液调整至OD600＝1.0，室温静置2-5h；上述悬浊液中包括：pH调至5.2的10mM MES-KOH，10mM MgCl₂,100μM乙酰丁香酮；

S10：将S9得到的菌液使用前经涡旋震荡或移液枪吸打悬浮菌体，然后用没有针头的1mL注射器吸取上述菌液，避开叶脉，用上述1mL注射器针在苹果叶片上开小孔后，将菌体液注射入叶片中，每个叶片注射1-2个孔；

S11：注射农杆菌4天后观察叶片。