[发明专利]竞争性表达的IL-12和IL-23及其基因、重组载体和在制备治疗肿瘤药物中的应用

权利要求书

1.一种竞争性结合形成IL-12和IL-23的方法，其特征在于，该方法是通过IL-12p35和/或IL-23p19与IL-12p40竞争性结合来实现的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IL-12p40、IL-12p35和IL-23p19都是天然的，或其活性变体，所述IL-12p40核苷酸序列为SEQ1；IL-12p35核苷酸序列为SEQ3；IL-12p19核苷酸序列为SEQ5。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活性变体与其母本或天然的氨基酸序列有至少60％或以上同一性的氨基酸序列，活性变体具有其母本或天然氨基酸序列具有的活性。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活性变体为通过基因工程或蛋白质工程获得的变体。

5.利用权利要求1-4任一项所述方法构建的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括：病毒载体、真核表达载体、原核表达载体、mRNA载体、p40蛋白亚基、p35蛋白亚基或p19蛋白亚基。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体包括：痘苗病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒或水泡性口炎病毒。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为靶向性溶瘤痘苗病毒载体，通过在痘苗病毒的TK区插入IL-12p40基因、A49R区插入IL-12p35和IL-23p19基因，通过基因合成得到的。

8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为靶向性溶瘤痘苗病毒表达载体，该病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)参考痘苗病毒序列：GenBank:DQ121394.1，合成TK基因上游序列SEQ7、TK基因下游序列SEQ8、IL-12p40核苷酸序列SEQ1；

依次将TK基因上游序列、LoxP、H5启动子、报告基因红色荧光蛋白RFP、LoxP、H5、IL-12p40和TK基因下游序列，连接到质粒载体pUC57上，构建穿梭载体pTK-p40；

(2)根据TK区设计gRNA序列SEQ11，将gRNA连接到PB-gRNA载体上构建PB-gRNA-TK；根据A49R区设计gRNA序列SEQ12，将gRNA连接到PB-gRNA载体上构建PB-gRNA-A49R；

(3)将CV1细胞接种到六孔板上，当细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB-gRNA-TK，经过24小时后感染野生型痘苗病毒VV，2小时后转染pTK-p40；再经48小时收集上清和细胞的混合液，冻融3次，按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中；48小时后，在荧光显微镜下挑取红色荧光的单克隆细胞；将单克隆溶液冻融后按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中，48小时后再次挑取单克隆细胞，直至荧光显微镜下全部为红色荧光，即为病毒载体VVΔTK-p40-RFP；

(4)将CV1细胞接种到六孔板中，当细胞达到90％以上的融合度时，转染Cre质粒，再经过24小时后感染病毒VVΔTK-p40-RFP；再经过48小时挑取无红色荧光的克隆细胞，经过多轮挑选，直至完全无荧光，即为病毒载体VVΔTK-p40；

(5)分别合成A49R基因上游序列SEQ9、IL-12p35核苷酸序列SEQ3、IL-23p19核苷酸序列SEQ5、A49R基因下游序列SEQ10；

依次将A49R基因上游序列、FRT、H5、RFP、FRT、H5、IL-12p35、P2A、IL-23p19和A49R基因下游序列，连接到质粒载体pUC57上，构建穿梭载体pA49R-p3519；

(6)将CV1细胞接种到六孔板上，当细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB-gRNA-A49R，经过24小时后感染VVΔTK-p40，2小时后转染pA49R-p3519；再经过48小时，收集上清和细胞的混合物，冻融3次，按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中；48小时后在荧光显微镜下挑取红色荧光的单克隆细胞；将单克隆溶液冻融后按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中，48小时后再次挑取单克隆细胞，直至荧光显微镜下全部为红色荧光；获得重组溶瘤痘苗病毒载体VVΔTKp40ΔA49Rp3519。