[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫定点整合外源基因位点及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供一种柔嫩艾美耳球虫定点整合外源基因位点及其应用。本发明涉及转基因柔嫩艾美耳球虫定点整合外源基因位点的筛选、质粒构建及其应用。本发明公开了一个柔嫩艾美耳球虫高效整合位点信息，外源基因整合到该位点后不仅能够稳定地遗传还可以一定程度地提高转基因球虫的繁殖力。本发明还提供了质粒载体，包括：定点整合位点同源左臂，外源基因和定点整合位点同源右臂，该载体是依托CRISPR/Cas9打靶系统所设计的，所述质粒载体能够将外源基因精确地引入到球虫基因组特异性位点中，从而解决球虫转基因技术外源基因随机整合，以及转基因球虫外源基因丢失的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫定点整合外源基因位点及其应用。

背景技术

鸡球虫是顶复门、艾美耳属的真核单细胞寄生原虫，它们在鸡肠道的不同部位繁殖，破坏肠上皮细胞，引起消化吸收功能障碍，导致饲料转化率降低、鸡只生长迟缓等，严重时会造成雏鸡大规模死亡，目前仍是国内阻碍养鸡业集约化发展的重要病原之一。目前公认的鸡球虫共有7种，其中柔嫩艾美耳球虫是致病性最强也是当下转基因研究最深入的鸡球虫。

转基因技术是艾美耳属球虫研究的有力工具，在球虫疫苗活载体、球虫基因表达调控、球虫功能基因以及球虫耐药性和新药物靶基因等研究中均发挥了重要作用。目前鸡球虫转基因操作主要以基于限制性内切酶介导的整合(restriction enzyme-mediatedintegration,REMI)方法实现将外源载体基因片段整合到球虫基因组，运用限制性内切酶介导的转染方法，可将柔嫩艾美耳球虫的转染效率提高100倍以上，而后借助药物筛选基因和流式细胞筛选(FACS)可快速提升转基因球虫的比例。

但由于REMI方法会使得外源基因在球虫基因组上随机整合，这也导致了不同转基因球虫个体表达量差异大，整合位点和外源基因拷贝数检测繁琐等问题，同时也发现转基因球虫在经过连续多次传代培养后存在外源基因部分甚至全部丢失的问题。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术以其操作简单、构建载体成本较低等优势迅速成为了基因组编辑的主流技术，并普及发展成为现代生命科学实验必不可少的工具之一。

随着CRISPR/Cas9系统在柔嫩艾美耳球虫上成功的应用，为球虫基因编辑技术提供了新的选择。鉴于该技术具有精确切割基因组的特性，使得CRISPR/Cas9成为实现外源基因定点插入柔嫩艾美耳球虫基因组的首选方法。

球虫生活史复杂，包括三个生殖阶段，即裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖。并且球虫作为真核生物，虫体内存在基因组修复机制，这使得外源基因即使定点插入后也会有被修复的可能，从而导致插入基因片段的丢失。因此，若要实现外源基因在球虫虫体内的稳定存在且持续表达，还需筛选球虫的基因组安全港(Genomic Safe Harbor,GSH)作为外源基因的整合位点。在球虫的基因组定位安全有效的基因插入位点，不仅能够推动球虫作为活疫苗载体的进一步研究，同时也将有助于球虫功能基因组学的发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于定位柔嫩艾美耳球虫基因组中安全有效的外源基因插入位点，提供定点整合质粒载体及其靶向该位点整合外源基因中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下。

第一方面，本发明提供柔嫩艾美耳球虫基因组位点HG994969.1:2704213-270525在转基因球虫制备中的应用，所述柔嫩艾美耳球虫基因组位点HG994969.1:2704213-270525作为外源基因整合位点。即柔嫩艾美耳球虫基因组位点HG994969.1:2704213-270525作为外源基因整合的基因组安全港。

本发明通过对实验室现有转基因柔嫩艾美耳球虫基因组经过重测序分析，利用嵌合体reads发现外源基因整合至HG994969.1:2704213-2705255时，外源基因能够稳定存在，且不影响球虫内源基因的表达。