[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的非洲马瘟病毒可视化快速检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种核酸组合物，其特征在于，所述组合物包括非洲马瘟病毒特异性引物对和特异性crRNA，所述特异性引物对和特异性crRNA是针对非洲马瘟病毒Segment 7基因；

所述特异性引物对序列如下：

上游引物：5’-CACAAGATGTTATGCGTATGTWTCTCCCACT-3，

下游引物：5’-CGCAACAATTTCATTCCTYTCAGTCGGTGG-3’，

其中，W是A/T，Y是C/T；

所述特异性crRNA序列如下：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCAGCAGAUGAAUAUGCAGCCUA-3’；

所述特异性引物对中，上游引物简并碱基W中A/T比例为2:1,下游引物简并碱基Y中C/T比例为1:1。

2.一种用于检测非洲马瘟病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的核酸组合物；所述试剂盒中还包括Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液；所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol，所述buffer溶液的pH值为7.5-8，所述buffer中Mg²⁺浓度为5-10mM。

3.权利要求1所述的核酸组合物在制备检测非洲马瘟病毒的试剂盒中的应用，所述检测包括如下具体步骤：

1)使用核酸快速释放剂快速提取马属动物病料或库蠓等媒介生物的核酸；

2)加入权利要求1所述核酸组合物中的游特异性引物进行MIRA扩增反应，反应条件为：37-39℃，10-15min；

3)加入权利要求1所述核酸组合物中的特异性crRNA，以及添加Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液，进行CRISPR-Cas12a反应；反应条件为：37-42℃，10-15min；

4)结果判定，将反应管置于蓝光下，出现绿色荧光，即为非洲马瘟阳性；

所述步骤3)中，所述crRNA使用终浓度为100-400pmol，所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol；所述buffer pH值为7.5-8，buffer中Mg²⁺浓度为5-10mM。