[发明专利]一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法

说明书

本发明涉及流式细胞术领域，具体涉及一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法。所述细胞固定破膜剂的成分包括：多聚甲醛、甲醇、破膜剂、胎牛血清、磷酸盐缓冲液，本发明通过合理适当的调整甲醇与多聚甲醛的浓度配比，可以达到优势互补的作用，减小对细胞形态及细胞散射特性的改变，细胞固定破膜后，固定效果好，细胞抗原活性较好，且可以实现固定破膜一步完成，操作简便。

技术领域

本发明涉及流式细胞术领域，具体涉及一种用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法。

背景技术

随着流式细胞检测技术的广泛应用，以及胞内染色技术的成熟，结合细胞内染色技术可用流式检测多种胞内蛋白以及细胞因子，流式细胞技术能够对细胞进行多参数检测，具有速度快、精度高、准确性好的特点，通过流式细胞技术检测多种胞内蛋白以及细胞因子得到广泛应用。

实验室在检测细胞因子、细胞器和胞浆转录因子等胞浆蛋白以及转录因子、DNA结合蛋白、修饰蛋白等核蛋白时，需要先对细胞形态以及胞内蛋白进行固定。固定剂能够较好的维持细胞固有形态和形态，防止细胞自溶，以避免细胞透膜时发生破裂，使胞内蛋白凝固，维持细胞抗原活性，使抗原不发生弥散。并且对具有传染性的标本能够杀死病原菌，从而起到防止疾病传播的作用。

固定细胞时应尽可能保证样本新鲜，保证加入足量的固剂，固定时间不宜过长。不同种类的固定剂对细胞的穿透力不同，可能导致多糖、蛋白质、核酸、脂类和低分子质量物质等不同程度的丢失，由于固定剂因素会导致组织细胞形态的改变，以及影响抗体的荧光强度，所以需要选择适合的固定剂，良好的固定剂可使组织固定均匀、收缩小、结构清晰，利于保存组织细胞的抗原性。常见的固定剂主要包含醛类、氧化剂类、蛋白变性类等类型。其中甲醛是最常用的固定剂之一，甲醛具有对组织细胞损伤较少，能较好保存固有物质，对细胞穿透力较强，固定均匀，成本低等有点，常用于多种混合固定剂的配置。

在细胞正常生理状态下，荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入胞内与抗原结合，需要在染色前先加入破膜剂，利用破膜剂在细胞膜上打孔，以便抗体进入胞内。破膜不足以及破膜过度都会影响荧光染色效果和结果分析。常见的破膜剂包括皂苷、TritonX-100、Twe en-20、有机溶剂等。皂素相较其他破膜剂更温和，但其破膜效果是可逆的，且无法破核膜，若经过后期多步洗涤操作，容易导致破膜失败。TritonX-100、Tween-20不仅可以破坏所有脂质层，也可破核膜。有机溶剂可实现固定和破膜，如甲醇、乙醇、丙酮等。

流式检测时固定细胞的方法通常为向细胞样品管中加入适量的4％多聚甲醛先进行固定，固定完成后使用洗涤液进行多次洗涤，将固定剂彻底洗去，再进行破膜，多次洗涤，抗体孵育，上机检测样品，实验步骤繁琐。多聚甲醛固定细胞时起主要作用的是甲醛单体，甲醛中的醛基能与蛋白质中的氨基基团之间形成亚甲基桥和羟甲基衍生物，使甲醛与蛋白质末端基团之前形成交联链，从而导致蛋白质沉淀。这种蛋白质变性能够固定结构蛋白，抑制内源性酶，防止细胞的裂解和组织的自溶，较好地保护了组织细胞的形态结构。但固定后往往会影响细胞形态，改变细胞的散射特性，导致细胞分群变化较大，并且使用的多聚甲醛浓度较高，毒性较大，对实验人员本身会造成一定损伤。

发明内容

为了解决传统的流式细胞检测胞内蛋白或细胞因子的方法样品制备步骤繁琐，且细胞固定破膜后，会导致细胞形态大小以及散射特性的变化较大，导致细胞分群的改变的技术问题，本发明提供了一种用于流式检测的细胞固定破膜剂。

具体的，本发明的技术方案如下：

一种用于流式检测的细胞固定破膜剂，所述试剂的成分和含量如下：

进一步的，所述破膜剂为TritonX-100、皂苷、Tween-20中的一种。

一种用于流式细胞检测的细胞固定破膜剂的使用方法，步骤如下：