[发明专利]一种β-半乳糖苷酶、编码基因、工程菌及在制备低聚半乳糖中的应用

说明书

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶、编码基因、工程菌及在制备低聚半乳糖中的应用，β‑半乳糖苷酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明β‑半乳糖苷酶可将乳糖转化为低聚半乳糖，其产率为35％。同时，从产物纯度来看，获得的低聚半乳糖产物比较单一，分子量分布更窄，更适宜于工业化生产的下游提取和精制单元操作。

(一)技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶，特别涉及一种来源于阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)Zjut HJ2001菌株的β-半乳糖苷酶、编码基因、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用。

(二)背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，E.C.3.2.1.23)，是一类重要的能水解β-半乳糖苷键的糖苷水解酶类，可利用乳糖生产低聚半乳糖。低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，广泛应用于婴幼儿配方奶粉、糖果产品、烘焙食品、家畜饲料等领域。目前已有不同来源的野生型β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖，然而野生型β-半乳糖苷酶分离困难，酶活较低，限制了其大规模的制备及应用。

因此，构建表达活性高的β-半乳糖苷酶基因工程菌具有实际的应用意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Zjut HJ2001菌株的β-半乳糖苷酶、编码基因、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用，鉴于野生型β-半乳糖苷酶存在分离困难且酶活较低的问题，本发明获得的工程菌更适宜于β-半乳糖苷酶的生产和分离纯化，且从产物纯度来看，本发明获得的低聚半乳糖产物比较单一，分子量分布更窄，更适宜于工业化生产的下游提取和精制单元操作。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Zjut HJ2001的β-半乳糖苷酶，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶的编码基因，所述β-半乳糖苷酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZjutHJ2001保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022197，保藏日期为2022年3月4日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编，430072。已在中国发明专利CN202210691233.5中公开。

任何对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有99％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种含有所述β-半乳糖苷酶编码基因的重组载体及一种由所述重组载体构建的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌构建方法为：将含有目的基因的重组表达载体pET-28a(+)-βgal转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal，即所述重组基因工程菌。

本发明还涉及一种所述β-半乳糖苷酶基因在构建β-半乳糖苷酶中的应用，所述应用为：构建含有所述β-半乳糖苷酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组β-半乳糖苷酶的菌体细胞。

本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶在制备低聚半乳糖中的应用，所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶编码基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的纯酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和底物乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～200rpm条件下振荡反应10～30h，反应结束后，煮沸3min灭活，即得低聚半乳糖粗品。