[发明专利]一种炭疽菌CsMBLAC基因及应用

说明书

本发明提出了一种炭疽菌CsMBLAC基因及应用，所述CsMBLAC基因包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，所述炭疽菌为暹罗炭疽菌。本发明还提供CsMBLAC基因突变体及其构建方法。本发明克隆了CsMBLAC基因，构建了CsMBLAC基因敲除突变体，经过功能性实验，与暹罗炭疽菌HN08相比，CsMBLAC基因敲除突变体的菌落生长受到显著抑制，证实了该基因参与调控真菌对咯菌腈等吡咯类药剂的敏感性。本发明获得的CsMBLAC基因可以作为药物靶标，能够抑制CsMBLAC基因表达的药物，都可作为抑制真菌生长的杀菌剂。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种炭疽菌CsMBLAC基因及应用。

背景技术

B类β-内酰胺酶，也称金属β-内酰胺酶(Metallo-beta-lactamasedomain-containingprotein,MβLs)，是一类依靠一个或两个锌离子作为活性中心的水解酶(zinc-bindingdehydrogenase)，也是一个种类繁多的超级家族。MβLs主要产于一些病原菌，它能够水解几乎所有的抗生素，包括碳青霉烯类和最新一代头孢菌素类抗生素。它通过活性位点的Zn(II)进攻抗生素的β-内酰胺功能环，酰胺键断裂，当该环被破坏后就会失去其应有的抗菌活性，无法与细菌的青霉素结合蛋白共价结合，MβLs耐药基因在细菌中传播使其成为“超级细菌”，导致临床上的抗生素失去效力，使越来越多的细菌感染性疾病无药可用。在临床医学上研究金属β-内酰胺酶的抑制剂尤其重要，但还没有任何一种针对MβLs的抑制剂可以抑制MβLs的活性。此外，真菌中金属β-内酰胺酶的研究较少，尤其在对吡咯类杀菌剂抗性调控功能方面的研究还未见报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提出一种炭疽菌CsMBLAC基因及应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一，本发明提供一种炭疽菌CsMBLAC基因，所述CsMBLAC基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述炭疽菌为暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)。

第二，本发明提供一种炭疽菌CsMBLAC基因敲除突变体的构建方法，包括以下制备步骤：

(1)第一轮PCR，两对引物CsMBL-UF/CsMBL-UR和CsMBL-DF/CsMBL-DR分别扩增CsMBLAC基因上臂序列和C端后的下臂序列；引物CsMBL-UR和CsMBL-DF分别含有氯嘧磺隆抗性基因接头序列，引物S1F/S2R扩增得到氯嘧磺隆抗性基因；

第二轮PCR，引物CsMBL-UF/CsMBL-DR融合CsMBLAC基因上臂和下臂片段以及氯嘧磺隆抗性基因片段，得融合产物；

(2)第三轮PCR，引物CsMBL-UF/CsMBL-DR富集融合产物，遗传转化，获得转化子，筛选鉴定；

所述引物CsMBL-UF、CsMBL-UR、CsMBL-DF、CsMBL-DR、S1F和S2R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述筛选鉴定的方法为：

以所述转化子的基因组DNA为模板，四对引物鉴定CsMBLAC基因敲除突变体，所述四对引物分别是CsMBL-OF/CsMBL-OR、CsMBL-UouF/S1R、S2F/CsMBL-DouR、CsMBL-UouF/CsMBL-DouR，引物CsMBL-UouF/CsMBL-DouR可扩增出目的片段的转化子为阳性CsMBLAC基因敲除突变体；

所述引物CsMBL-OF、CsMBL-OR、CsMBL-UouF、S1R、S2F、CsMBL-DouR的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.15所示。