[发明专利]一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，其特征在于，该试剂盒具体包括：

(1)DNA提取试剂盒；

(2)PCR扩增反应液；

(3)基因芯片；

(4)各种引物。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒包括：微量核酸提取装置、细胞裂解液、清洗液及洗脱液、抽吸装置。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述微量核酸提取装置包括管状主体，管状主体一端设有用于与抽吸装置连接的接头，另一端为插头，用于与核酸结合的滤芯装置安装于管状主体或插头内；微量核酸提取装置的管状主体与插头为一体或由管状主体与插头两个部件连接而成，其中，所述插头为锥状。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液各组分的浓度如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5’端带生物素标记的分枝杆菌16SrRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL，TaqDNA聚合酶2-5U/100μl。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针，其中探针为SEQIDNos.1-31或与SEQIDNos.1-31互补的序列；标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.32；结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.33。

6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述探针5′或3′端经过胺基化处理。

7.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物包括用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQIDNos.34-41。

8.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上的。

9.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。

10.一种制备如权利要求1～9任意一项所述结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的所述结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括：

S1：PCR扩增反应液的制备，根据现有技术合成上述5’端带生物素标记的分枝杆菌16SrRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物，用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5-12.5μmol/L；取5-10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；

S2：基因芯片的制备，对结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的三个主要耐药基因rpoB、katG和inhA的主要突变位点的核苷酸探针、标记有生物素点的DNA序列、结核分枝杆菌复合群的IS6110DNA序列进行合成，制得合成探针；用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。

S3：结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配，将基因芯片和PCR扩增反应液装入一容器。