[发明专利]一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法

权利要求书

1.一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、微生物发酵产(-)γ-内酰胺酶

选产(-)γ-内酰胺酶的菌株作为种子，经28℃、150r/min培养得种子液，再以体积分数2.0％～8.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量15％～35％，培养温度25℃～32℃，转速为110～180rpm，通气量1vvm～3vvm，初始pH5.0～9.0，发酵20～60h后收集发酵液；

步骤二、粗酶液的获得

将步骤一获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液洗涤3次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中，进行细胞破碎，破碎后10000rpm离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用；

步骤三、酶液浓缩

将步骤二所得的(-)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，浓缩时使用10kD离心超滤管；测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；

步骤四、生产(-)γ-内酰胺

利用步骤三中获得的浓缩酶液无菌转化(±)γ-内酰胺；其中，转化体系的温度为24℃～35℃，搅拌速度为150rpm，转化24～60h，并向转化体系中加入抗生素，得到的(-)γ-内酰胺用液相法检测浓度。

2.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤一中所述经28℃、150r/min培养的培养基包括酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，KH₂PO₄7g/L，Na₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.4g/L，FeSO₄0.02g/L，CaCl₂0.02g/L，NH₄Cl 5g/L，调节pH7.0。

3.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤一所述产酶发酵培养基为葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，Tween-801g/L，KH₂PO₄7g/L，Na₂HPO₄1.5g/L，Mg₂SO₄0.4g/L，pH7.5。

4.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，所述的产(-)γ-内酰胺酶的菌株为嗜冷杆菌，购自中国菌种保藏中心，编号为Bio-091077。

5.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤二中所述低温高速离心的条件具体为4℃，12000rpm。

6.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤二中所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.0。

7.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤三中所述浓缩温度为4℃，浓缩条件为10000r/min离心30min。

8.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤四中加入的抗生素占转化体系体积分数的0.1％～0.2％。

9.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法，其特征在于，步骤四中所述的抗生素为卡纳或四环素。