[发明专利]一种鉴别和定量检测多子小瓜虫的引物组及应用

权利要求书

1.一种鉴别多子小瓜虫的引物组，该引物组包括引物Ich_18S_568F、Ich_18S_656R、

Ich_18S_597P，序列如下：

Ich_18S_568F：5’-GCTCGTAGTTGAACTTCTGCC-3’；

Ich_18S_656R：5’-AACCAGTGAAGGCCGAGTTTG-3’；

Ich_18S_597P：5’-FAM-AGCTGGGTTCTCTTAGCTAAAATGGGC-MGB-3’；

该引物组不仅可以区分多子小瓜虫和其他淡水纤毛虫，而且可以在世界各地的不同多子小瓜虫株系间通用。

2.一种鉴别多子小瓜虫的试剂，该试剂包括权利要求1所述的引物组。

3.一种鉴别多子小瓜虫的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物Ich_18S_568F、Ich_18S_656R、Ich_18S_597P，还包括Taq DNA Polymerase,PCR Buffer,dNTP和Mg²⁺。

4.一种使用权利要求1所述引物组鉴别和定量检测多子小瓜虫的qPCR方法，该方法包括步骤：(A)提取待检测样本的DNA；(B)制备多子小瓜虫SSU rDNA标准质粒；(C)配制qPCR反应体系，包含TaqMan Mixture、权利要求1所述的引物组、样品DNA和足量的无菌RNase/DNase free water；设置实验组、对照组和标准曲线；TaqMan Mixture含有GoldStar TaqDNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Mg²⁺；(D)使用CFX Connect执行扩增程序；(E)qPCR的数据使用Bio-Rad CFX Maestro软件分析。

5.如权利要求4所述的鉴别和定量检测多子小瓜虫的qPCR方法，引物与探针浓度为200nM:100nM。

6.一种使用权利要求1所述引物组鉴别和定量检测多子小瓜虫的ddPCR方法，具体步骤为：(A)提取待检测样本的DNA；(B)配制ddPCR反应体系，包含2×ddPCR Supermix forProbes(Bio-Rad)、权利要求1所述的引物组、样品DNA和足量的无菌RNase/DNase freewater；设置实验组和对照组；(B)使用QX200 droplet generator(Bio-Rad)将反应体系分为上万个微滴，然后将微滴转移到96孔板中用PX1 PCR Plate Sealer热封；(C)将96孔板放置在T100Touch thermal cycler(Bio-Rad)中进行PCR扩增；(D)使用QX200 dropletreader(Bio-Rad)读取微滴的荧光信号；(E)ddPCR的数据使用Bio-Rad QuantaSoftsoftware 1.7进行分析。

7.如权利要求6所述鉴别和定量检测多子小瓜虫的ddPCR方法，引物与探针浓度为500nM:250nM。

8.如权利要求4或5所述方法的应用，用于监测多子小瓜虫病的流行情况。

9.如权利要求6或7所述方法的应用，用在成分复杂的水环境中检测出极为少量的多子小瓜虫DNA。

10.如权利要求4或6所述方法的应用，用于预警多子小瓜虫病的暴发或提示用药预防。