[发明专利]一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法在审
申请号: | 202211534835.6 | 申请日: | 2022-11-30 |
公开(公告)号: | CN115725520A | 公开(公告)日: | 2023-03-03 |
发明(设计)人: | 张言慧;袁建国 | 申请(专利权)人: | 山东国力生物技术研究院;山东国力生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N9/00 | 分类号: | C12N9/00;C12N15/52;C12N1/21;C12P21/02;C07K5/037;C12R1/19 |
代理公司: | 济南日新专利代理事务所(普通合伙) 37224 | 代理人: | 杨亚男 |
地址: | 250100 山东省济南市高新*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 谷胱甘肽 合成 制备 方法 催化 生产 | ||
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。本发明所述方法对Listeria monocytogenes来源gshF基因序列进行优化后得到SEQ ID NO.1所示碱基序列,以此为模板构建工程菌;通过对发酵培养基的优化,最终获得了高活性的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶。本发明所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高。
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一种含有γ-酰胺键和巯基的三肽化合物,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸这三种氨基酸通过肽键缩合而成,化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸。谷胱甘肽有还原型和氧化型两种类型,谷胱甘肽的主要活性成分是还原型谷胱甘肽。谷胱甘肽具有解毒、抗氧化、抗惊厥、抗血栓和抗动脉粥样硬化作用。由于谷胱甘肽在众多领域的运用,并且目前大多数的谷胱甘肽的原料药都依赖于进口,大大增加了谷胱甘肽的用药成本和研发经费,所以谷胱甘肽的制备备受国人的关注。谷胱甘肽的制备方法主要有溶剂提取法、发酵法、化学合成法和酶合成法。化学合成法制备GSH,是将L-Glu、L-Cys和Gly经过基团保护、缩合以及脱保护三阶段的一系列化学反应合成GSH,是谷胱甘肽早期的生产方法,生产工艺也较为成熟。但这种方法存在很多缺陷,例如反应步骤繁多,反应时间长,操作过程难度大,产生需要光学拆分的消旋体使得不易分离,谷胱甘肽纯度不高以及对环境会造成污染等。溶剂提取法主要是通过萃取和沉淀相结合的方法,从富含GSH的动植物、酵母等生物组织中提取产物,先使用适当的溶剂或者结合蛋白酶、淀粉酶处理,再进行分离和精制得到最终产物。萃取法的原料以酵母居多,一般使用的都是未经选育和遗传性改造的,因此本身产品含量就低,再通过复杂的工艺流程处理后,总收率很低,致使该方法的成本高,可推广性较差。
专利CN109593735A采用重组菌表达一种双功能谷胱甘肽合成酶,但该酶来自于蜡状芽孢杆菌,并且该专利为加入0.5%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),不仅增加了纯化负担,也不利于谷胱甘肽及ATP分子透过细胞膜壁。
李斯特菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶由两个功能性蛋白结构域组成,催化GSH合成的两步反应,见下式。
Streptococcus pasteurianus、Streptococcus infantarius、Streptococcusagalactiae及Streptococcus thermophilus这4种不同菌种来源的双功能酶氨基酸序列相似度达79%,因为它们均为革兰氏阳性菌,同属于链球菌属。Actinobacilluspleuropneumoniae、Pasteurella multocida及Haemophilus parainfluenzae来源的双功能酶氨基酸序列同源性高于80%,可能是因为它们都为革兰氏阴性菌,属于γ-变形菌门。李斯特菌来源的GSH F与其它几株含有双功能酶的菌株同源关系较远,属于厚壁菌门。不同菌种来源的GSH F系统发育树见图1。
发明内容
本发明主要目的是提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。本发明所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高,适用于GSH的大规模生产。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一方面,提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法,所述方法包括以下步骤:
工程菌的构建:编码谷胱甘肽合成酶的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,表达载体为pET-28a(+),宿主菌为:Escherichia coli BL21(DE3)。
将所述工程菌进行种子培养;
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