[发明专利]一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用。该试剂盒可以在避免引入外源细胞和外源基因的情况下诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板，采用该试剂盒可以高度模拟体内巨核细胞和血小板的生成过程，将干细胞依次诱导成中内胚层细胞、造血内皮细胞，并产生巨核红系祖细胞，巨核红系祖细胞进一步发育为具有多倍体特征的巨核细胞，最终产生具有与天然血小板相似功能性的干细胞源血小板，并且干细胞具有无限增殖的潜能，在体外可以大量扩增，这也为血小板的体外制备提供无限的细胞来源。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用。

背景技术

血小板是骨髓中成熟的多核巨核细胞经细胞骨架重排和胞浆裂解后脱落下来的小块胞质，在血液循环中能存活5～7天。在人体内，血小板的主要作用是作为止血和血栓形成的调节剂；此外，血小板对破损血管的修复和血管内皮的保护具有重要的功能；同时，也有研究证明血小板在先天性免疫、调节肿瘤生长和血管外渗中有重要的作用。正常人体内每升血液中含有100～300亿个血小板。在临床上许多疾病，如再生障碍性贫血、白血病和系统性红斑狼疮等，会导致血小板数量的减少。当人体内每升血液中血小板的数量低于10～20亿个的时候，止血系统会出现严重的障碍，有导致自发性出血的风险，需要注射血小板进行治疗。目前，用于临床治疗的血小板主要来源于献血者，一个血小板治疗单位至少需要250亿个血小板，需要从1升全血中提取出来，相当于需要5个献血者来完成；而且，由于血小板在体内的存活时间仅有1周左右，因此血小板治疗的药效期是有限的。对于血小板含量长期不足的患者，需要反复注射血小板来维持治疗效果。血小板的来源有限，需求量甚大，这无疑会造成严重的医疗压力。因此，急需寻找除献血来源之外的血小板获得途径。

巨核细胞在体内的发育是一个复杂的过程。首先，位于造血谱系发育顶端的造血干细胞在骨髓中经过不对称分裂形成两个细胞，一个是保持自我更新能力的造血干细胞，另一个是能发育为多种造血谱系但缺乏自我更新能力的造血祖细胞。随后，造血祖细胞经细胞因子的诱导和特定转录因子的调控，向髓系祖细胞或淋巴系祖细胞分化。当髓系祖细胞产生后，其能继续发育并产生具有向红系和巨核系双向分化潜能的巨核红系祖细胞。巨核红系祖细胞在细胞因子EPO和转录因子KLF1等因素的调控下能发生偏向红系谱系的发育；再在细胞因子TPO和转录因子FLI1等因素的调控下能发生偏向巨核谱系的发育，并迁移到骨髓血窦附近的位置。分化早期的巨核细胞首先表达CD61和CD41a两个特异性的免疫标志物。随着巨核细胞发育成熟，表面抗原CD42a、CD42b和CD42d等陆续开始表达，并在成熟阶段表达水平达到最高；CD42b的表达可能会随着血小板的产生而逐渐丢失。通过对体内巨核细胞的转录组学分析，发现人体内至少存在着三种不同功能的成熟巨核细胞，包括对造血干细胞的维持起支持作用的巨核细胞、具有免疫应答作用的巨核细胞以及具有产生血小板能力的巨核细胞。生产血小板巨核细胞的一个特征是，在发育成熟阶段能发生特有的核内有丝分裂，DNA能发生复制形成多倍体，但胞质不能进行分裂，从而导致成熟的产血小板巨核细胞形成多倍体细胞。成熟多倍体巨核细胞具有更高的蛋白质合成能力，为血小板的产生提供充足的物质基础。

目前，多种细胞可用于血小板的生物制造，包括从骨髓、外周血、脐带血中分离的造血干细胞，以及多能干细胞等。与多能干细胞相比，造血干细胞作为血小板的前体细胞，其向巨核细胞和血小板分化的“路程”更加直接快捷。造血干细胞可以从骨髓、外周血、脐带血中分离出来。不同来源的造血干细胞的增殖潜能、偏向巨核谱系的分化能力以及产生血小板的内在能力均有所差异。与脐带血造血干细胞相比，骨髓和外周血来源的造血干细胞分化得到的巨核细胞的多倍体水平更高，其产血小板的潜能更高。但脐带血的来源和储备量均优于前两者，因此脐带血来源的造血干细胞具有更强的竞争力，而且已有多个团队致力于造血干细胞体外分化血小板的研究并建立了相应的培养体系。