[发明专利]一种多聚磷酸盐激酶突变体及其在谷氨酰胺合成中的应用

说明书

本发明公开了一种多聚磷酸盐激酶突变体及其在谷氨酰胺合成中的应用，属于生物技术领域。本发明筛选获得了酶活显著提高的多聚磷酸盐激酶突变体，该突变酶的催化活性相较于原始酶提高了182.2％，能够实现ATP的高效率再生并降低生物催化成本。将本发明构建的聚磷酸盐激酶突变体用于生产谷氨酰胺，显著提高了ATP再生的可持续性，可使反应8h谷氨酰胺产量达94.4mM，转化率为94.4％，较偶联原始酶生产谷氨酰胺的产量提高了41.5％。

技术领域

本发明涉及一种多聚磷酸盐激酶突变体及其在谷氨酰胺合成中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种在生物体中常见的高能量磷酸化合物，由1分子腺嘌呤，1分子核糖和3分子磷酸基团组成。它为活细胞的合成、运输、信息传递等过程提供能量。其中作为一种重要的辅因子，参与许多需要能量的生物催化反应。直接向系统中添加ATP成本高，并导致副产物的积累，复杂化了下游分离过程。文献已报道多种酶可以用于ATP再生，例如：丙酮酸激酶(PK)、肌酸激酶(CK)、醋酸激酶(AK)和多聚磷酸盐激酶(PPK)等。然而，基于PEP、乙酰磷酸和肌酸的体系存在产物抑制、成本高或稳定性低等问题，可能限制这些技术在大规模生产中的应用。到目前为止，绝大多数ATP再生系统开始从ADP，例如生物催化反应中的羧酸还原为醛、酰胺键的形成和级联反应，对于S-腺苷蛋氨酸依赖的烷基化反应，需要ATP再生。大多数AMP到ATP再生系统使用两种酶，如腺苷酸激酶/醋酸激酶，或更复杂的混合物，如添加了乙酰磷酸的大肠杆菌裂解液。考虑到生物催化剂对工艺的成本限制，首选的是酶的数量最小化和最原始的形式催化。尽管这种体内级联的构建在传质限制、对宿主生物的产品毒性和复杂的下游过程等方面可能带来一些不利。PPKs由于其底物多聚磷酸盐(polyP)廉价易得，广泛应用于ATP再生。多聚磷酸盐(polyP)是一种无机线性聚合物，含有数千个磷酸盐残基，含有多种富能量的磷酸酐键，是一种储能材料，可以作为应激和生存、能量、细胞运动、生物膜形成和金属离子螯合剂。近年来，无机聚磷酸盐催化聚磷酸盐激酶(PPK)生成ATP的可逆反应引起了人们的广泛关注。在自然界中，polyP是由多聚磷酸盐激酶(PPKs)合成和降解的。PPKs根据系统发育树及催化性能可以分为两大类：PPK1和PPK2，PPK1偏向于合成polyP，PPK2偏向于合成ATP，此外根据不同的结构和生化特性，PPK2又可以分为三类：PPK2Ⅰ、PPK2Ⅱ、PPK2Ⅲ。通常，PPK2Ⅰ和PPK2Ⅱ的底物偏好导致相应的ADP产生ATP，PPK2Ⅲ是双功能酶，可以由AMP形成ADP和ATP。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过筛选和高通量突变多聚磷酸盐激酶高效生产ATP的方法，克服现有技术的不足。

技术方案：

为解决上述技术问题，本发明通过筛选不同来源的多聚磷酸盐激酶，并通过相关性质的测定，筛选得到催化能力较好的多聚磷酸盐激酶ChPPK。

本发明提供了一种多聚磷酸盐激酶突变体，是以SEQ ID NO.8所示的出发序列的基础上，将第103位氨基酸进行了突变。

在一种实施方式中，所述突变是将第103位赖氨酸突变为缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pET28a(+)或pXMJ-19。

本发明还提供表达所述突变体的重组微生物。

在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)和pXMJ-19质粒为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组微生物还表达谷氨酰胺合酶。