[发明专利]一种腈水解酶及其在蛋氨酸合成中的应用

说明书

本发明公开了一种腈水解酶及其在蛋氨酸合成中的应用。本发明公开的腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明的腈水解酶能够高效催化2‑氨基‑4‑甲硫基丁腈生成2‑氨基‑4‑甲硫基丁酸，尤其是突变体ScNLE‑F188A底物转化率达到99％，2‑氨基‑4‑甲硫基丁酸的生产效率高达29.8kg_蛋氨酸/kg_DCW/h，对于绿色高效地制备蛋氨酸具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种来源于珊瑚希瓦氏菌(Shewanellacorallii)的腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法及其在制备2-氨基-4-甲硫基丁酸中的应用。

背景技术

蛋氨酸是构成蛋白质的基本单位之一，是动物生长所需氨基酸中唯一含硫的必需氨基酸，是家禽玉米-豆粕型饲粮中的第一限制性氨基酸。

制备蛋氨酸的方法主要有化学合成法、生物酶拆分法和微生物发酵法。生物酶拆分法的生产经济指标低、排污大；发酵法的生产工艺收率低，欠缺工业化生产价值；目前全球蛋氨酸的生产主要采用化学合成法，相关专利由全球主要化工巨头发起，例如杜邦、陶氏化学、住友株式会社等。

目前，氰醇法是运行成本最低的蛋氨酸生产工艺之一，优点在于既能用来生产蛋氨酸，又能用来生产蛋氨酸羟基类似物及其钙盐，因而被美国杜邦公司、孟山都公司等采用。氰醇法中间体2-氨基-4-甲硫基丁腈采用硫酸在高温高压条件下水解，存在反应条件苛刻、副产三废多等问题。

利用生物催化法来进行腈的转化，其优势不仅在于反应条件温和、环境污染少，副产物少，并且符合原子经济性、绿色环保和可持续发展的要求。

曹达公司和罗纳-普朗克公司等都对腈水解酶催化的2-氨基-4-甲硫基丁腈水解制备2-氨基-4-甲硫基丁酸工艺进行了研究，其反应如式(I)所示。采用Alcaligenesfaecalis、Gordaon terrae、Rhodococcus sp.等来源的腈水解酶生物催化剂的生产效率仅为0.6-0.9kg蛋氨酸/kg_DCW/h，仍处于较低水平。

综上所述，在现有的腈水解酶参与的生物催化法制备蛋氨酸技术路线中，仍然存在关键酶腈水解酶水解反应生产效率较低的问题，限制了其在工业规模的应用。因此，通过基因组数据挖掘等方法开发高催化效率的腈水解酶，绿色高效地制备蛋氨酸具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法以及利用其作为催化剂，绿色高效水解制备蛋氨酸的应用，从而解决现有的腈水解酶催化合成蛋氨酸的技术存在的产品生产效率不高的问题。

本发明的发明人从德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的菌株保藏编号为DSM 21332的珊瑚希瓦氏菌(Shewanella corallii)中获得可以催化2-氨基-4-甲硫基丁腈水解制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的腈水解酶ScNLE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；通过进一步对腈水解酶ScNLE进行分子手段的改造，得到一种将其第188位苯丙氨酸替换为丙氨酸的突变体ScNLE-F188A，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；与ScNLE相比，ScNLE-F188A的2-氨基-4-甲硫基丁酸的生产效率显著提高，达29.8kg_蛋氨酸/kg_DCW/h。

在第一方面，本发明提供一种腈水解酶ScNLE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其可以催化2-氨基-4-甲硫基丁腈水解制备2-氨基-4-甲硫基丁酸。