[发明专利]新型冠状病毒重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将ELABELA信号肽和新型冠状病毒S-RBD蛋白的编码基因导入到毕赤酵母中，获得毕赤酵母重组菌株；

步骤(2)：对步骤(1)所述毕赤酵母重组菌株进行单克隆挑取，培养，冻存，获得毕赤酵母工程菌种子；

步骤(3)：取步骤(2)所述毕赤酵母工程菌种子，接入培养液活化，至培养液OD₆₀₀达到4.0～7.0获得活化液；对所述活化液进行培养，至活化液OD₆₀₀达到5.0～8.0获得发酵液I；

步骤(4)：取步骤(3)所述发酵液I与基础盐培养基BSM混合，发酵至菌体湿重达到120～160g/L，与诱导剂混合，诱导，获得发酵液II；

步骤(5)：取步骤(4)所述发酵液II进行离心，收集上清液，获得所述新型冠状病毒重组蛋白。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ELABELA信号肽和新型冠状病毒S-RBD蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或

所述ELABELA信号肽和新型冠状病毒S-RBD蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述接入包括取200μL所述毕赤酵母工程菌种子接入20mL所述培养基；和/或

所述培养基包括YPD培养基；和/或

所述活化的转速为160～180r/min；和/或

所述活化的温度为30～32℃；和/或

所述活化的时间为18～30h。

4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养包括取2～5mL所述活化液接入200～500mL YPD培养基的步骤；和/或

所述培养的转速为180r/min；和/或

所述培养的温度为30℃；和/或

所述培养的时间为18～30h。

5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中5L所述基础盐培养基BSM的制备方法包括：将2.0～3.0g的K₂SO₄、8.0～12.0g的MgSO₄、0.5～1.0g的CaSO₄、20.0～25.0g的磷酸二氢铵、1～2mL的H₃PO₄、2～3g的KOH、200～250g的甘油、20～30mL的PTM₁和0.5～1.0mL的消泡剂混合，加去离子水定容至5L，使用磷酸调节pH至4.5～5.0；和/或

所述H₃PO₄包括85％浓磷酸；和/或

所述消泡剂包括SIGMA生产的Antifoam；和/或

所述PTM₁的制备方法包括：称取硫酸铜6.0g、碘化钾0.09g、硫酸锰3.0g、钼酸钠二水0.2g、硼酸0.02g、氯化钴0.5g、氯化锌20g、硫酸亚铁65g和浓硫酸5.0mL，加水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌；和/或

所述硫酸铜包括五水合硫酸铜(II)；和/或

所述硫酸锰包括一水合硫酸锰；和/或

所述氯化钴包括六水合氯化钴；和/或

所述硫酸亚铁包括七水合硫酸亚铁。

6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述发酵液I与所述基础盐培养基BSM的体积比为1:15～1:7.5；或

步骤(4)中所述基础盐培养基BSM的体积为5L，且所述发酵液I的体积为333mL～667mL。

7.如权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述发酵的温度为29.0～30.0℃；和/或

所述发酵的初始pH为5.0～5.3；和/或

所述发酵的起始转速为200rpm；和/或

所述发酵的溶解氧为10％～50％；和/或

所述发酵的时间为16～20小时。