[发明专利]一种用Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法

说明书

本发明涉及牛血清技术领域，具体公开了一种用Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法，先对Vero细胞进行单克隆，然后加入对Vero细胞进行培养的牛血清，最后用96孔板测定法测定Vero细胞单克隆后形成的克隆总数，记录单细胞形成的克隆总数并计算相应的克隆率；通过对比在不同的牛血清下Vero细胞的克隆率，判断不同牛血清的质量，本发明通过将牛血清配合MEM培养基对Vero细胞进行细胞单克隆培养，在利用96孔板对Vero细胞进行培养后，通过对Vero细胞的单克隆培养率进行计算以及对比，Vero细胞的单克隆培养率越高，则所利用培养的牛血清质量越好。

技术领域

本发明涉及牛血清技术领域，具体涉及一种用Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法。

背景技术

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能，牛血清提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物，牛血清提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力，牛血清在有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用，牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源，牛血清起酸碱度缓冲液作用，牛血清提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害等优点。胎牛血清和新生牛血清是疫苗企业、生物制药企业、诊断企业和科研院校的生产和研究中重要的原辅材料。

疫苗生产企业或研究单位判断牛血清的好坏通常采用《药典》中牛血清的检测标准，《药典》在的血清检测标准中有杂交瘤细胞的单细胞克隆率要求，而疫苗生产企业实际生产中一般不用杂交瘤细胞，生产中常用Vero细胞、二倍体细胞等细胞。我们根据血清的实际使用情况，开发了一种Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法，本专利方法通过96孔板每个孔平均分3个细胞(实际数量在后面显微镜观察中记录)，记录单细胞的孔，培养7天记录Vero细胞的单细胞孔形成的克隆数量跟原始接种细胞的比率来计算Vero细胞的克隆率，评价该血清的品质，作为判断该血清在客户生产中是否适用的一个指标。

我们在生产和检验中发现胎牛血清或新生牛血清品质好，能让单个的Vero细胞很快贴壁、增殖，形成一个细胞克隆群落。好的胎牛血清Vero细胞的单细胞克隆率能达到90％以上，比国外的胎牛血清Vero细胞的单细胞克隆率略好。新生牛血清Vero细胞的单细胞克隆率在70％以上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法，能够检测胎牛血清或新生牛血清的质量；

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明公开了一种用Vero细胞的单细胞克隆率检测牛血清的方法，先对Vero细胞进行单克隆，然后加入对Vero细胞进行培养的牛血清，最后用96孔板测定法测定Vero细胞单克隆后形成的克隆总数，记录单细胞形成的克隆总数并计算相应的克隆率；通过对比在不同的牛血清下Vero细胞的克隆率，判断不同牛血清的质量。

其中，对Vero细胞进行单克隆包括以下步骤：

S1：用MEM培养基加8-12％的胎牛血清配制培养液，Vero细胞传2代，取1瓶第2代生长良好的细胞进行消化计数；

S2：将细胞稀释至浓度为30×104个/ml的细胞悬液10ml，再进行10倍系列稀释至每1ml含30个/ml细胞浓度，并按3个/孔的细胞浓度接种于96孔细胞培养板，每板接种96孔；

S3:培养2小时观察，记录只有1个细胞集落的孔数，记录单细胞形成的克隆总数。

优选地，S1中选用的胎牛血清的含量优选为10％。

优选地，S1中的Vero细胞的单克隆细胞传代是单层铺满率为90％～100％。

优选地，S3中细胞培养环境为37℃、5％CO2。