[发明专利]一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用。一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA，所述的pGX‑DsRed‑ITRs‑TTAA含有3’ITRS‑DeRed‑5’ITRS元件，其中DsRed基因不含有BbsI识别位点，DsRed基因序列上、下游分别为pigggBac转座子3’和5'ITRS，3’和5'ITRS引入分别引入了BbsI和BsaI内切酶位点，且紧邻TTAA序列。利用本发明质粒构建果蝇基因组无缝编辑所需同源臂供体质粒，可以将质粒构建从多片段连接改为可以通过单酶切引入同源臂至载体，降低载体构建难度，提高成功率。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

目前，对于果蝇基因组的编辑广泛使用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9核酸内切酶进行，该酶可在sgRNA的引导下作用于特定的基因组序列，产生DNA双链断裂，利用同源定向修复机制可实现对靶基因的特异性敲除或敲入。如果在基因敲除的同时敲入attP位点，则后期可利用phiC31同源重组酶介导attB位点与attP位点之间发生基因重组，进而在靶基因敲除位置引入不同基因突变。由于phiC31同源重组酶介导的同源重组效率较高，因而该方法使用广泛。但是该方法在使用过程中会在敲入基因的两端引入50bp以上的外源序列，给实验结果带来不可预计的影响。为实现对果蝇基因组的无缝编辑，科研人员将CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用，首先运用CRISPR/Cas9技术，利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记，然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除，达到对基因组进行无缝编辑的效果。将这一原理运用在果蝇基因组的敲除过程中，可以利用杂交手段方便高效地移除筛选标记，具体方法见发明人于已发表的文章。该方法在运用CRISPR/Cas9技术引入基因突变及筛选标记时，须将敲除基因两侧的同源序列精准地与载体TTAA序列连接，否则后续将无法被piggyBac转座子酶识别并切除，因此无法利用限制性内切酶分别插入两侧同源臂，只能将两个同源臂、两侧带有ITR的筛选标记DsRed以同源重组的方式与载体进行多个片段的同源重组，但是多个片段的同源重组连接难度较大，其效率受限于片段的大小、浓度、及反应体系中不同片段的浓度，因此通常连接效率较低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体。

本发明的另一目的是提供该质粒载体的构建方法。

本发明的又一目的是提供该质粒载体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX-DsRed-ITRs-TTAA，所述的pGX-DsRed-ITRs-TTAA含有3’ITRS-DeRed-5’ITRS元件，其中DsRed基因不含有BbsI识别位点，DsRed基因序列上、下游分别为pigggBac转座子3’和5'ITRS，3’和5'ITRS引入分别引入了BbsI内切酶位点，BsaI内切酶位点，且紧邻TTAA序列。质粒载体pGX-DsRed-ITRs-TTAA主要元件的示意图如图1所示。

作为本发明的一种优选，所述的pGX-DsRed-ITRs-TTAA的骨架载体pGX-attP-DsRed为以M5-ΔUAST-Rpr-FRT_DsRed质粒为基础，同义突变消除AmpR基因中含有的BsaI内切酶识别位点所得，M5-ΔUAST-Rpr-FRT_DsRed质粒序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的进一步优选，所述的质粒载体pGX-DsRed-ITRs-TTAA序列如SEQ IDNO.1所示，质粒图谱见图2。

本发明所述的质粒载体pGX-DsRed-ITRs-TTAA的构建方法，包含以下步骤：