[发明专利]一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA及其应用

权利要求书

1.一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA包括SEQID NO:15所示的核苷酸序列。

2.一种endA基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA和Cas9。

3.根据权利要求2所述的endA基因编辑系统，其特征在于，所述endA基因编辑系统还包括供体质粒；

优选地，所述供体质粒包括修复模板endA-HA；

优选地，所述特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA和修复模板endA-HA连接在同一个pTargetF质粒中；

优选地，所述修复模板endA-HA的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

优选地，所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

4.根据权利要求3所述的endA基因编辑系统，其特征在于，所述供体质粒采用如下步骤构建得到：

(a)采用引物EndA-LHA-F和EndA-LHA-R以STBL3基因组为模板扩增endA基因修复模板Left-HA；采用引物EndA-RHA-F和EndA-RHA-R以STBL3基因组为模板扩增修复模板Right-HA；

(b)将所述修复模板Left-HA和修复模板Right-HA用引物EndA-LHA-F和EndA-RHA-R进行PCR，得到修复模板endA-HA；

(c)采用引物pTargetF-1F和pTargetF-1R以pTargetF质粒为模板扩增片段pTargetF-1；采用引物pTargetF-2F和pTargetF-2R以pTargetF质粒为模板扩增片段pTargetF-2；

(d)将endA-HA、pTargetF-1和pTargetF-2采用无缝克隆组装成供体质粒。

5.根据权利要求4所述的endA基因编辑系统，其特征在于，步骤(a)中，所述引物EndA-LHA-F包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述引物EndA-LHA-R包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

优选地，步骤(a)中，所述引物EndA-RHA-F包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述引物EndA-RHA-R包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

优选地，步骤(c)中，所述引物pTargetF-1F包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述引物pTargetF-1R包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

优选地，步骤(c)中，所述引物pTargetF-2F包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述引物pTargetF-2R包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

6.一种重组大肠杆菌STBL3，其特征在于，所述重组大肠杆菌STBL3含有权利要求1所述的特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA；

优选地，所述重组大肠杆菌STBL3含有权利要求2-5中任一项所述的endA基因编辑系统；

优选地，所述重组大肠杆菌STBL3为经过权利要求2-5中任一项所述的endA基因编辑系统编辑后，基因组中敲除了endA基因的大肠杆菌STBL3。

7.一种权利要求6所述的重组大肠杆菌STBL3的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将权利要求2-5中任一项所述的endA基因编辑系统导入大肠杆菌STBL3细胞内，筛选阳性克隆，消除pCas质粒和供体质粒，得到所述重组大肠杆菌STBL3。