[发明专利]一种新型奶牛原代脂肪细胞培养方法

说明书

本发明的一种新型奶牛原代脂肪细胞培养方法，涉及细胞工程技术领域，其包括细胞分离、细胞培养和细胞分化等步骤。本发明技术先进且操作简单、细胞培养基配制科学合理。利用改良的方法进行分离，培养基质‑血管细胞，继而分化，最终获得成熟的奶牛脂肪细胞。通过体外改良的基质‑血管细胞分离、培养和分化方法，成功建立了奶牛原代脂肪细胞体外培养的新模型，缩减了脂肪细胞的分离时间，且所获得细胞状态最好，培养稳定分化效率高，是一种更为便捷高效的原代脂肪细胞培养方法。为深入研究奶牛脂肪细胞发育和代谢过程中不同基因、蛋白的表达及所参与信号通路奠定基础，同时为预防奶牛围产期营养代谢和代谢疾病提供新的体外模型与技术参考。

技术领域：

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种新型奶牛原代脂肪细胞培养方法。

背景技术：

脂肪细胞的体外培养为研究脂肪代谢及相关疾病提供了一种有效途径，目前致力于明晰脂肪组织发育与代谢的大部分研究都是在体外进行。脂肪细胞的原代培养及分化方法也得到了广泛的研究，各种家畜的脂肪细胞培养模型得以建立，但在国内，脂肪细胞培养方面的研究起步较晚，且多集中于人及鼠的脂肪细胞培养。近年来，国内也陆续开展了对奶牛脂肪细胞的研究，目前所采用的培养方法为组织块培养法。组织块培养法所分离的脂肪细胞增殖时间较长，一般需要18-20天，另外，在增殖完成后使用传统分化方法将脂肪细胞诱导分化至成熟还需要12-15天。因此，现有的奶牛原代脂肪细胞培养及分化方法所需试验周期较长，且分化效率较低，需要消耗大量的人力和物力。

发明内容：

为了解决技术背景中提出的问题，本发明旨在提供一种分离培养奶牛基质-血管细胞，并体外诱导其分化为成熟脂肪细胞的方法。该方法具有分离快速、增殖稳定、分化率高等优点，为研究奶牛脂肪组织发育及代谢提供了技术手段，同时也为奶牛的营养代谢调控及围产期营养代谢病研究提供了体外模型。

本发明的一种新型奶牛原代脂肪细胞培养方法，所述方法的操作步骤如下：

(1)细胞分离：

a、麻醉处理健康的一日龄荷斯坦犊牛，并在无菌条件下通过外科手术方法获得采集来自大网膜的脂肪组织；

b、将所采集的脂肪组织分别移入含有青霉素(2,500U/ml)和链霉素(2,500mg/ml)的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，漂洗4次以除去粘附的血液，并于无菌培养皿中利用眼科剪及眼科镊剥离脂肪组织中可见的筋膜及血管；

c、将所得组织切成约1mm3的小块，加入Ⅰ型胶原酶消化液，于37℃，120rpm/min的振荡水浴中孵育1小时；

d、通过200μm细胞过滤网从混合物中除去未消化的组织，将含有胶原酶消化物的滤液通过500rpm/min离心5分钟；吸取底层液体，加入细胞培养基1500rpm/min离心10min从培养基中分离底层基质-血管细胞。弃上清，加入红细胞裂解液1500rpm/min离心10min去除红细胞。使用权利要求1中所述的基础培养基重悬细胞，以1×10⁴cells/cm²接种至细胞培养瓶，置于37℃、5％CO₂条件下于细胞培养箱中进行培养；

(2)细胞培养：使用权利要求1中所述的基础培养基重悬细胞，并以1.8×10⁵cells接种至六孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂条件下于细胞培养箱中培养6天：

(3)细胞分化：

a、将培养基更换为权利要求2中所述的分化培养基，诱导分化2天；

b、将培养基更换为权利要求3中所述的增殖培养基，维持分化2天；

c、将培养基更换为权利要求1中所述的基础培养基，进一步维持分化2-4天直至出现明显脂滴，表示脂肪细胞分化成熟。