[发明专利]全身性过表达人源α-Syn-NLS转基因鼠的构建方法

说明书

本发明公开一种全身性过表达人源α‑Syn‑NLS转基因鼠的构建方法，本发明方法首先通过PCR方法获取人源α‑Syn编码序列和SV40核易位信号序列，再通过BP反应构建含有目的序列的入门克隆载体，酶切后，通过LR反应将入门克隆载体构建成含有目的序列的重组表达载体，再酶切后，以慢病毒LV过表达载体pLV‑EGFP:T2A:Puro‑EF1A为骨架载体，将含有目的序列的重组表达载体pDown‑hSNCA/SV40NLS构建入慢病毒载体中，进行病毒包装纯化得到过表达核输入α‑Syn的pLV病毒，采用受精卵原核注射方法注射该病毒，获得全身过表达核输入人源α‑Syn蛋白的转基因鼠，能长期稳定的过表达α‑Syn，并同时解决核输入的问题，该模型对研究α‑Syn核输入的全面功能和机制具有重要的价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源α-Syn-NLS过表达的慢病毒载体及转基因鼠的构建方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种年龄相关的慢性进行性神经系统疾病，其主要病理特征表现为中脑黑质纹状体多巴胺能神经元的变性或死亡及路易小体的形成，路易小体由α-突触核蛋白(SNCA,简称α-Syn)为主的蛋白质异常聚集而形成。然而，α-Syn蛋白在PD中的功能及致病机制尚未完全研究清楚。小鼠动物模型是研究α-Syn蛋白质功能及PD发病机理的一个重要工具，尽管已经开发出许多模型，如α-Syn蛋白的转基因动物模型，部分能表现出黑质及纹状体多巴胺能神经元减少或多巴胺水平降低以及行为障碍，但在大多数小鼠中都没有发现明显的黑质及纹状体变性，不能完美地再现PD的病理特征，给PD的研究带来了困扰，并且由于在生理条件下，α-Syn蛋白主要分布于细胞质中，少量分布于细胞核内，而且由于α-Syn蛋白与路易小体在细胞质共定位，所以先前大多数关于α-Syn蛋白的研究主要集中在细胞质中，而忽略了细胞核中的α-Syn蛋白。随着近年来PD患者脑组织中发现α-Syn蛋白的核定位现象，人们逐渐意识到细胞核中α-Syn蛋白的重要性，有研究结果表明在帕金森病(AD)和阿尔兹海默病(PD)患者大脑及氧化应激的细胞中，均发现α-Syn蛋白趋向于向细胞核中聚集，且这些异常的核聚集与细胞毒性相关。因此对细胞核中α-Syn蛋白的研究也越来越多。尽管我们前期研究中用过表达病毒载体pAAV-IRES-hrGFP构建了α-Syn-3*NLS重组腺相关病毒载体，并且通过侧脑室注射该病毒获得全脑过表达核易位人源α-Syn蛋白转基因鼠，这种转基因鼠的优点是因为局部注射到脑部位，脑部位可以快速表现出相关病理症状，缺点是不能全身性表达，表达持续时间也有待研究。针对α-Syn异常聚集引起的胃肠反应或除脑部以外的神经系统的研究，pAAV-IRES-hrGFP-Syn-3*NLS转基因小鼠存在缺陷的。

慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样，其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上，由于病毒载体经改构后，不在宿主细胞增殖，不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代；这种载体的最大优势是能感染静止细胞、不产生嵌合体动物和稳定遗传。

发明内容