[发明专利]多色示踪联检方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种多色示踪联检方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取红色胶乳微球，加入纯化水中稀释混匀，加入MES缓冲液，室温下混合均匀，边搅拌边缓慢加入新冠病毒N蛋白的检测抗体，加入后计时，室温下持续搅拌反应；向上述反应液中加入EDC溶液，室温下继续搅拌反应；向上述反应液中加入胶乳封闭液，室温搅拌混匀，加入胶乳封闭液后立即进行均质或超声分散，离心，弃去上清，用硼酸硼砂缓冲液和BSA对沉淀进行复溶重悬；将重悬得到的胶乳进行均质或超声分散，取分散胶乳，用纯化水稀释后检测粒径，得到红色胶乳-抗体复合物；

2)用步骤1)的相同方法制备抗甲流病毒抗原检测抗体与蓝色胶乳微球的复合物和抗乙流病毒抗原检测抗体与黑色胶乳微球的复合物；然后在使用前将这几种复合物按1：1：1比例混合；

3)配置结合垫和NC膜，所述的结合垫内含有步骤1)与步骤2)得到包被有对应抗体的彩色胶乳抗体复合物，所述的NC膜为具备侧向层析功能的NC膜；用交联物稀释液稀释多色胶乳标记的检测抗体混合物，将稀释后的胶乳抗体复合物混合物均匀涂布在结合垫上，每根玻璃纤维的涂布量为10-50mL，在45℃下干燥24h；

4)利用结合垫将样本中的抗原与结合垫中的对应抗体的彩色胶乳相结合，形成抗原抗体复合物，同时抗原抗体复合物在NC膜上侧向层析，与NC膜上包被的捕获抗体形成双抗体夹心复合物；

5)双抗体夹心复合物在NC膜上富集后显色；

6)根据NC膜上富集显色的颜色和位置判断当前样本的病毒抗原的种类。

2.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，红色胶乳微球的粒径为100nm-500nm；步骤2)中，蓝色胶乳微球的粒径为100nm-500nm；黑色胶乳微球的粒径为100nm-500nm。

3.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，MES缓冲液的加入量为1.0-5.0mL，浓度为100-500mM，pH为4.5-6.5；EDC溶液的浓度为10mg/mL，加入量为0.05-0.15mL。

4.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，所述胶乳封闭液由1-3gBSA、0.1mL Proclin-300与-纯化水配制而成，加入量为0.1-0.5mL。

5.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，均质的参数为600-1500Bar；超声的参数为100w-200w，1-2s*10-20次，间隔4s。

6.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，检测粒径合格的条件为粒径小于500nm，PDI小于0.1。

7.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤1)中，离心的参数为10-25℃，23000g离心30min，使用5-15-0mL的0.05-0.2M硼酸硼砂缓冲液和1-5.0mL的50-200mg/mL BSA对沉淀进行复溶重悬。

8.根据权利要求1所述的一种多色示踪联检方法，其特征在于，步骤3)中，红色胶乳-抗体复合物，蓝色胶乳-抗体复合物与黑色胶乳-抗体复合物的质量比为1：1:1。

9.一种多色示踪联检试剂盒，其特征在于，包括用于与样本结合的结合垫、NC膜、背板以及吸水层，所述背板的中部配置有NC膜，NC膜的一侧交叠有结合垫，结合垫的外侧配置有吸水垫，所述NC膜的另一侧也配置有吸水垫，所述结合垫内含有若干种权利要求1-8任一项所述的包被有对应抗体的彩色胶乳抗体复合物，所述样本中的抗原与结合垫中的对应抗体的彩色胶乳相结合，形成抗原抗体复合物的同时，在NC膜上侧向层析，与NC膜上包被的捕获抗体形成双抗体夹心复合物，通过在NC膜上富集后显色的方式，判断当前样本的病毒抗原的种类。

10.根据权利要求9所述的一种多色示踪联检试剂盒，其特征在于，所述结合垫内含有三种包被有对应抗体的彩色胶乳，分别为红色胶乳-抗新冠病毒N蛋白的检测抗体复合物、蓝色胶乳-抗甲流病毒抗原检测抗体复合物以及黑色胶乳-抗乙流病毒抗原检测抗体复合物。