[发明专利]一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备及其应用

权利要求书

1.一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤1）：通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因RsPG1、过氧化氢酶基因RsCAT和钙调神经磷酸酶敏感的锌指蛋白基因RsCRZ1 3个基因的组合RsPG1-RsCAT-RsCRZ1-dsRNA，简称RsPCC-dsRNA片段，设带有同源臂的引物将RsPG1、RsCAT、RsCRZ1三个基因串联起来；其中：

RsCAT-dsF 引物序列为：acagcatctcgaaccgacactgctcgcgaccc;

RsCAT-dsR 引物序列为：tccgacagaacgagcccacttaaaggtatgtccagagt;

RsPG1-dsF 引物序列为：acgggggacgagctccgggaaagggtatcacattcaa;

RsPG1-dsR 引物序列为：gtcgcgagcagtgtcggttcgagatgctgtaggtatg;

RsCRZ1-dsF引物序列为：catacctttaagtgggctcgttctgtcggagatg;

RsCRZ1-dsR引物序列为：ccatgtcgactctagctcatgtcgcttgcagtcat;

步骤2）：利用引物对RsPG1-dsT7F/RsCRZ1-dsR和引物对RsPG1-dsF/RsCRZ1-dsT7R分别扩增出正义链5’-端带T7启动子和反义链5’-带T7启动子的模板，并回收纯化；其中:

RsPG1-dsT7F引物序列为: taatacgactcactatagggcgggaaagggtatcacattcaa;

RsCRZ1-dsR引物序列为: tcataccacaactccaccg；

RsPG1-dsF引物序列为: cgggaaagggtatcacattcaa；

RsCRZ1-dsT7R引物序列为: taatacgactcactatagggctcatgtcgcttgcagtcat；

步骤3）：根据诺唯赞T7 RNAi Transcription Kit说明书进行体外转录，最后纯化即RsPCC-dsRNA，将RsPCC-dsRNA与LDH纳米材料共孵育，将体外转录约1043 bp的RsPCC-dsRNA与LDH按不同质量比共孵育不同时间，用1%凝胶电泳评估dsRNA被负载情况，结果显示当dsRNA：LDH的质量比为1:2孵育2 h后，LDH可完全负载不同长度的dsRNA。

2.根据权利要求1所述的一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备方法，其特征是，步骤3）中，dsRNA纳米农药保存在-80℃冰箱备用。

3.一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的在防治立枯丝核菌病害上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，应用方法为：将合成的RsPCC-dsRNA稀释后喷施水稻叶片表面。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征是，RsPCC-dsRNA稀释到50 μg/μL后喷施水稻叶片表面。