[发明专利]一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法

说明书

本发明提供了一种特定组成的亲和层析缓冲液体系，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；所述亲和层析洗涤液是含有如下组分的pH为6.5～7.4的水溶液：0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠；所述亲和层析洗脱液是含有如下组分的pH为7.0～8.0的水溶液：0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸；使用本发明亲和层析缓冲液体系纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。

技术领域

本发明属于生物制品加工领域，具体涉及一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系及纯化方法。

背景技术

人凝血因子IX(coagulation factorIX,FIX)是一种维生素K依赖的由肝细胞合成并分泌到血液中的单链糖蛋白，由415个氨基酸残基组成，分子量约55KDa，含多糖17％左右。血浆中的含量约为5mg/L，半衰期12～24h。血液内循环的FIX为一种丝氨酸蛋白水解酶形式存在,经其他因子激活后参与活化的内源途径凝血级联反应，对于生理性凝血和止血有重要作用。由于FIX是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的纯化条件和凝胶的使用对FIX比活性有显著性影响，但是目前制备FIX的方法存在FIX比活性低和制备工艺复杂的问题。

例如，蔡骏等人在《柱层析法制备高纯人血FIX研究初探》中报告了一种用DEAE-Sephadex A50凝胶，DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子IX的方法，最终FIX比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4％。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子IX的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质，经过两步阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FIX。FIX比活达到99.40IU/mg，纯化倍数为3823倍，回收率约为30％；得到的产品比活性都偏低。

又如，公开号CN110257358A的专利申请《一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法》公开了一种采用DEAE Sephadex A50凝胶+非Ca²⁺依赖性IX因子免疫亲和层析制备高纯度人凝血因子的生产方法，该方法通过非Ca²⁺依赖性IX因子免疫亲和层析提高比活性，所制备的人凝血因子IX的比活性达到196.5IU/mg以上。但该方法采用免疫亲和层析制备人凝血因子IX，生产过程中存在配基脱落的风险，后续工艺中未采用有效的去除工艺；亲和层析步骤中洗脱缓冲液含0～2mol/L氯化镁，该物质对人体有一定毒性，但后续却未见有效的去除工艺。

再如，公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性，所制备的人凝血因子IX比活性较高，可达到150IU/mg。公开号CN111378029A的专利申请《一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法》公开了一种2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析纯化从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方式通过四步层析纯化制备FIX比活性可达到150IU/mg以上的制品。但上述两项专利申请由于其生产工艺繁琐，需经过4次层析步骤，本领域专业人士公知，每经过一次层析纯化步骤，均不可避免地会造成目标蛋白损失，因此该制备工艺产品得率较低；此外，4次层析步骤需消耗大量凝胶填料，生产成本极高，不便于大范围推广。

因此，目前亟需提供一种纯化方式简单，成本低廉的，可快速制备高纯度和高回收率高的FIX的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，以及使用该体系对人凝血因子IX进行纯化的方法。

本发明提供了一种人凝血因子IX纯化的亲和层析缓冲液体系，包括亲和层析洗涤液和亲和层析洗脱液；