[发明专利]一种人/动物体液中类固醇激素的定量检测方法和应用

权利要求书

1.一种人/动物体液中类固醇激素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备基质混合标准工作溶液：将多种类固醇激素标准品分别加入第一溶剂超声溶解获得类固醇激素单标标准储备液，将多种类固醇激素的单标标准储备液同时加入甲醇与水的混合溶液超声溶解获得类固醇激素混合标准储备液，再取类固醇激素混合标准储备液加入第二溶剂超声溶解，获得不同浓度的混合标准溶液，最后使用质量分数为1％的BSA溶液将各浓度混合标准溶液进行稀释，得到不同浓度的基质混合标准工作溶液；

步骤2，目标物提取：待测样本及不同浓度的基质混合标准工作溶液采用有机试剂蛋白沉淀法通过提取剂1、提取剂2提取分别获取上清液和蛋白沉淀；

步骤3，在线酶解-固相萃取：固相萃取柱用200μL甲醇活化，再用200μL水平衡，将硫酸酯酶和β-葡萄糖醛酸酶的混合溶液加载至固相萃取柱，弃去流出液，使硫酸酯酶和β-葡萄糖醛酸酶键合在固相萃取柱的填料上，将步骤2中获取的上清液二次加载至固相萃取柱上，关闭流出阀，将其置于37℃环境下在线酶解60分钟，缓慢打开流出阀，弃去流出液，分别使用淋洗剂1、淋洗剂2淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，最后使用洗脱剂1将固相萃取柱上目标物洗脱并收集至置于玻璃进样小瓶的玻璃内衬管中，补加水至流动相初始比例并混匀，得到待测上机样本和标准测试品；

步骤4，仪器分析：采用超高效液相色谱质谱联用法测定步骤3中的待测上机样本和标准测试品，根据保留时间和母-子离子对信息指认目标分析物，再根据目标分析物的选择离子对色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定待测样品中各种类固醇激素的含量。

2.根据权利要求1所述的人/动物体液中类固醇激素的检测方法，其特征在于，步骤1中包括以下条件中的任一项或多项：

A1)所述超声溶解的条件为：温度：冰水浴；超声时间：1～5min；

A2)所述第一溶剂超声溶解的情况为：雌酮、17α-羟基孕烯醇酮使用甲醇或乙腈与DMSO体积比为1：1的第一溶剂溶解，其余使用纯甲醇或纯乙腈溶解；所述第一溶剂为甲醇、乙腈、DMSO中的一种或多种；所述第二溶剂为甲醇、乙腈、水中的一种或多种；

A3)所述甲醇与水的混合溶液体积比为1：1至2：1；

A4)所述不同浓度的混合标准溶液中硫酸脱氢表雄酮的具体浓度为：200000、100000、50000、20000、10000、5000、2000、1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL，其余23种不同浓度的混合标准溶液的具体浓度为2000、1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL；

A5)所述使用1％BSA溶液将各浓度混合标准溶液进行稀释具体做法为：配制牛血清白蛋白质量分数为1％的水溶液，将各浓度混合标准溶液进行5倍稀释。

3.根据权利要求1所述的人/动物体液中类固醇激素的检测方法，其特征在于，步骤2中包括以下条件中的任一项或多项：

B1)所述有机试剂蛋白沉淀法为取200μL体液样本于1.5mLPP材质离心管，先加入200μL提取剂1后混匀1min，再加入200μL提取剂2后混匀1min，以12000rpm转速在3～5℃下离心10min；

B2)所述提取剂1中含有的7种同位素内标为：雌酮-d4、雌二醇-d4、孕烯醇酮-d4、17α-羟基孕烯醇酮-d3、孕酮-d9、睾酮-d3、皮质醇-d4，浓度皆为50ng/mL；

B3)所述提取剂2的2M乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH为5.2。