[发明专利]分子标记及其应用

说明书

本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及分子标记及其应用。本发明提供了分子标记在预测或鉴定禾本科植物亚油酸含量，和/或禾本科植物营养品质的改良中的应用；所述分子标记为位于禾本科植物第6号染色体的第1771240位的LAQ4位点；所述禾本科植物包括稻，所述稻包括水稻精米或水稻糙米。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及分子标记及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L)是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国粮食作物中种植面积最大、单产最高的作物。随着我国经济社会的不断发展，市场对营养、健康、美味的功能性稻米的需求逐渐增加。水稻的营养品质包括蛋白质、脂肪、维生素和微量矿物质元素等。其中，亚油酸(Linoleic acid)是一种人体不能自己产生，必须通过饮食获得的必需脂肪酸。亚油酸具有降低血脂、软化血管、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利，能起到防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积，有“血管清道夫”的美誉。开发提高稻米亚油酸含量的育种技术，培育高亚油酸含量水稻品种，能满足市场对高营养品质稻米的需求，是水稻营养品质育种的一个新方向。

目前已公开的提高稻米亚油酸含量的技术主要集中在基因编辑领域。水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因(OsFAD3.1和OsFAD3.2)存在2个拷贝，分别位于第11和第12染色体，且两者cDNA同源性达97.32％。陈晓军团队在不改变籽粒主要农艺性状的前提下，利用基因编辑技术通过转化一个载体同时敲除2个ω-3脂肪酸去饱和酶基因，阻断亚油酸转化亚麻酸的途径，从而提高了籽粒中亚油酸的相对含量。ABE等利用基因编辑技术敲除水稻控制油酸转化为亚油酸的关键酶基因——OsFAD2-1，发现油酸含量较野生型增加2倍。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA分子标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间只有个别核苷酸的差异等。SNP在生物基因组中分布广泛、数量多、遗传稳定，是物种中不同个体表型变异的主要遗传来源。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)是一种SNP基因分型技术，自面世以来，以其超高的灵活性、准确度和性价比迅速抢占市场，被业内称为“基因分型研究者指尖跳跃的珠链”。KASP是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。KASP包含三个部分：带有目标SNP的待测试DNA；KASP引物混合物(KASP Assay Mix)，含有两个不同的带有独特尾巴序列的等位基因特异性竞争正向引物，和一个共用反向引物；KASP主混合物，含有通用FRET(荧光共振能量转移)盒、ROX^TM被动参考染料、Taq聚合酶、游离核苷酸和MgCl₂。在PCR反应过程中，有一个等位基因特异性引物与目标SNP结合并延伸，从而将尾序列连接到新合成的链上进行补充复制。经过多轮的PCR扩增，FAM或HEX标记的寡核苷酸结合新的补充尾序列，从淬灭基团释放出荧光体，产生荧光信号。序列不断被扩增，荧光信号不断增强，最终到达反应终点，进行数据读取。通过终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，竞争性等位基因特异性PCR通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合来实现双等位基因鉴别。如果给定SNP的基因型是纯合的，则只会产生两种可能的荧光信号中的一种。如果基因型是杂合的，则会产生混合荧光信号。KASP具有多态性高、标记丰富、成本低、操作简单等优点，已经成为国际上SNP检测分析的主流方法之一。