[发明专利]一种NADPH氧化酶突变体及其应用在审
申请号: | 202211649389.3 | 申请日: | 2022-12-21 |
公开(公告)号: | CN115948355A | 公开(公告)日: | 2023-04-11 |
发明(设计)人: | 余允东;张和平;吴伟业;李小莲;陈佩欣 | 申请(专利权)人: | 中山百灵生物技术股份有限公司;中山俊凯生物技术开发有限公司 |
主分类号: | C12N9/02 | 分类号: | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/36;C12R1/19 |
代理公司: | 广东金穗知识产权代理事务所(普通合伙) 44852 | 代理人: | 赵李娜 |
地址: | 528400 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 nadph 氧化酶 突变体 及其 应用 | ||
本发明公开了一种NADPH氧化酶突变体及其应用,属于生物酶工程技术领域。所述突变体为在SmNOX的基础上,通过同源建模技术和定点饱和突变技术筛选得到;所述突变体为在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的NADPH氧化酶进行定点突变得到,所述点突变为T114E、I116F或P118S,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。本发明得到的3种SmNOX酶突变体的单位酶活为4.6~6.0U/mg,较原SmNOX酶提高1.4~1.9倍,可更有效地用于相关的氧化还原反应中,在制药、食品、精细化工、农药等领域有良好的应用前景。
技术领域
本发明属于生物酶工程技术领域,涉及一种NADPH氧化酶,尤其是一种NADPH氧化酶突变体及其应用。
背景技术
氧化还原酶是一类重要的生物催化剂,在制药、食品、精细化工、农药等领域都具有重要的用途,主要是用来制备手性化合物,例如羟基酸类、氨基酸、类固醇、手性醇类等等。氧化还原酶在进行生物催化时,辅酶(NAD,NADP)起着电子转移的作用,随着反应的继续进行,辅酶会逐渐减少,最终导致反应中止,要继续反应,就需要不停的补充辅酶,所以辅酶的高效供应是开发氧化还原酶催化反应的关键技术之一。但是辅酶价格昂贵,在生产过程中大量投加补充辅酶显然是不切实际的。因此,从工业应用的经济效益角度来看,氧化还原酶在应用中除了必须有合适的酶和反应工程技术以外,还必须提供高效、低成本的辅酶再生系统。
辅酶再生,就是把辅酶从氧化态再生为还原态,或者反之,从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。为了解决辅酶再生这一问题,已经提出一系列的方法,包括化学、光化学、酶学和电化学等再生系统,其中酶法再生系统具有反应条件温和、催化效率低、环境友好等优点而受到广泛重视。在常见的氧化态辅酶再生体系中,NAD(P)H氧化酶是极具潜力的氧化型辅酶再生体系之一,因为NAD(P)H氧化酶能直接使用分子氧作为氧化剂,不需要其他辅助底物或介质,从而降低成本;产物为水或者过氧化氢,无需处理副产物或副产物处理简单,十分有利于在工业生产中应用。
本发明旨在开发一种用于NADP+高效再生的氧化酶,选择NAD(P)H特异性的变形链球菌NAD(P)H氧化酶2(SmNOX)作为突变的模板。选择SmNOX的原因是它稳定、活性高、不需要额外添加FADH或DTT,且能在大肠杆菌中高效表达。同时SmNOX可直接利用氧气直接进行辅酶NADP再生,并且属于少数产生水而不是过氧化氢的NADH氧化酶,无副反应产物,因此非常适合用作构建辅酶循环系统。
点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门新兴技术,是通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。目前广泛地应用于蛋白质改造及结构—功能关系研究中。如利用点饱和突变技术鉴定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。本发明运用点饱和突变技术与同源建模技术相结合在SmNOX上进行改造,从而获得NADP+高效稳定再生的突变体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化活性提高的NADPH氧化酶突变体及其应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种NADPH氧化酶突变体,所述NADPH氧化酶突变体为在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的NADPH氧化酶进行定点突变得到,所述点突变为T114E、I116F或P118S,对应的所述NADPH氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8所示。
本发明的NADPH氧化酶突变体为对来源于变形链球菌Streptococcus mutans的NADH氧化酶2(SmNOX)进行突变筛选得到,所述NADH氧化酶2(SmNOX)的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示,氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。SmNOX的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司合成所得,基因序列针对大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化。
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