[发明专利]检测非结核分枝杆菌耐药基因及变异的探针库及试剂盒

说明书

一种检测非结核分枝杆菌耐药基因及变异的探针库及试剂盒，本发明针对非结核分枝杆菌耐药基因设计对应探针，通过特异性捕获耐药相关片段，提升耐药基因变异检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测，更具体地涉及一种检测非结核分枝杆菌耐药基因及变异的探针库及试剂盒。

背景技术

分枝杆菌属于放线菌目、分枝杆菌科，主要包括结合分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。其中，非结核分枝杆菌广泛存在于我们周围的环境中。目前已鉴定出180多种NTM，主要包括海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等。非结核分枝杆菌易引起肺部及皮肤感染，引发肺部疾病最为常见。而大多数NTM对常用的抗MTC药物均耐药，因此，在临床上，对NTM的鉴定与耐药性检测十分重要。

临床上NTM的抗菌药物敏感性试验(AST)有很多种，例如绝对浓度法、电阻法、比例法、抑菌圈法等，其中CLSI认证的金标准是微量肉汤稀释法。传统的NTM鉴定方法由于耗时较长，往往会延误患者的治疗。同时，由于体内外环境差异、培养时间较长等原因，微量肉汤释稀法检测NTM的抗菌药物敏感性有时会与临床结果存在着较大的差异，所以亟需更快速更准确的检测技术。相比于传统检测方式，NGS方法在检测时间、通量以及准确性上具备诸多优势，因而针对重症感染及ICU感染具有传统方法无法比拟的优势。

通过NGS对16S rRNA、rpoB等靶标基因的检测可以精确地将NTM鉴定至种与亚种的水平。与此同时，NTM的耐药相关基因也得到了广泛的研究，例如，鸟分枝杆菌复合体(MAC)中16S rRNA的第1408、1409和1411对碱基对被认为与阿米卡星耐药相关，堪萨斯分枝杆菌中rpoB基因第513、526和531对碱基对与利福平耐药性相关，脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌在16S rRNA基因第1408对碱基对的突变与氨基糖苷类抗生素耐药相关。针对耐药基因的测序可以精确检测出NTM的耐药性，从而为临床提供更有效的指导。

mNGS(metagenomics next-generation sequencing)，也称宏基因组二代测序技术，是一种不需要培养，可直接从环境/临床样品中提取全部微生物的核酸序列，通过与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的高通量测序方法。可广泛分析临床样本微生物组(细菌、真菌、病毒)。相比传统培养方法，mNGS拥有更高敏感性以及更快的检测速度。

尽管mNGS用于临床病原诊断具有诸多优势，但其技术仍然面临着一些挑战。采样时样本难以完全排除人源细胞，而人类基因组的大小(3Gb)远大于细菌的基因组(3Mb)，样本中人源核酸的比例远高于目标病原的核酸，导致在测序中真正有意义的病原核酸片段比例较低，因此在耐药基因及变异的检测上，mNGS技术仍面临着灵敏度不足的问题，尤其考虑到检测成本，数据量有限导致耐药相关基因覆盖度较低，难以高灵敏度地检测出相关耐药基因及变异。

tNGS(Targeted next-generation sequencing)，也称靶向二代测序技术。靶向测序通过先富集目的DNA序列、再测序的方法，增加测序数据中目标序列的比例，进而提高检测的灵敏度。靶向富集的方法有两种，一种是多重PCR策略通过PCR反应增加目的片段的数量，另一种是通过核酸探针与目的片段进行杂交，从而抓取目的序列进行测序。探针法使用的探针长度通常为30～120bp，探针的数量可以从少于50个到超过200万个不等。探针法可以提高研究检测的灵敏度，另外可以应用于耐药基因的检测。

现有的病原体靶向的技术一般使用多重PCR技术富集目的基因，但由于多重PCR所用引物相较于保守，所以仅适合目标明确，区域不大的应用，无法在更大范围内检测。

此外，现有技术中使用质谱的方法，需要与标准品数据库中的DNA对比，不能检测未知的突变。

发明内容