[发明专利]β-1，6-葡聚糖酶基因及检测引物、应用

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种β‑1，6‑葡聚糖酶基因及检测引物、应用。本发明提供了一种β‑1，6‑葡聚糖酶基因，所述β‑1，6‑葡聚糖酶基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。所述β‑1，6‑葡聚糖酶基因经密码子优化，能导入水稻受体，在水稻中实现高表达，进而提高水稻对真菌性病害的抗性。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种β-1，6-葡聚糖酶基因及检测引物、应用。

背景技术

水稻是世界上主要谷类作物之一，也是全球30亿人口主要粮食来源。然而，由于常年遭受生物胁迫，水稻安全生产会受到影响，其中因各种病害造成的产量损失在30％以上。水稻真菌性病害主要包含由死体营养型病原菌Rhizoctonia solani Kühn引起的纹枯病、由半活体营养型真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病和由活体营养型真菌Ustilaginoidea Virens引起的稻曲病。

目前人们防治病害主要措施为喷洒农药，然而由于病原体的抗药性增强，对自然生态系统的破坏以及农药残留等问题，有必要寻找更安全可靠的防治途径来保证世界粮食安全。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种β-1，6-葡聚糖酶基因，所述β-1，6-葡聚糖酶基因经密码子优化，能导入水稻受体，在水稻中实现高表达，进而提高水稻对真菌性病害的抗性。

β-1，6-葡聚糖是真菌细胞壁中十分重要的组分，可以与其它分子β-1，3-葡聚糖，几丁质和糖磷脂酰肌醇锚定分子(GPI)交联维持细胞稳定。β-1，6-葡聚糖酶能够专一切割β-1，6-糖苷键，可以靶向真菌细胞壁从而抑制真菌生长。GluM是一种β-1，6-葡聚糖酶，来源于粘细菌Corallococcus sp.菌株EGB中，能够水解真菌细胞壁，进而参与捕食稻瘟病菌。基于植物体基因表达和细菌基因表达的差异性，一般认为细菌来源的基因在植物体内难以表达得到正常活性的蛋白。很多微生物来源的基因由于其序列特征在水稻中的表达可能存在异常。现有研究中，GluM基因功能的验证仅在微生物中进行，并没有在植物特别是没有在水稻转化中进行验证。

在本发明中，所述β-1，6-葡聚糖酶基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因是一种人工合成和修饰的新的GluM蛋白编码序列，通过对原始序列进行密码子优化，以提高植物偏爱密码子的使用频率、去除可以形成复杂二级结构的序列、去除富含AT碱基的序列，同时，去除常用的限制性内切酶酶切位点。本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因相比原始基因序列的GC含量降低，可以避免GluM基因在水稻中异常转录和翻译；GluM基因相比原始基因序列限制性内切酶识别位点数量显著降低，有利于基因工程操作。在本发明提供的实施例中，采用农杆菌介导的粳稻遗传转化法，将所述的GluM基因导入受体水稻品种中花11中，可以获得GluM基因单拷贝且GluM基因表达正常的抗真菌性病害水稻品种GZ12。经验证，所述水稻品种GZ12对水稻稻瘟病、纹枯病和稻曲病抗病均具有良好抗性。说明本发明提供的β-1，6-葡聚糖基因利于基因工程操作，能在水稻中表达得到正常活性的GluM蛋白。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括所述β-1，6-葡聚糖酶基因的核苷酸序列。

在本发明提供的优选实施方式中，所述生物材料包括人工合成序列；所述人工合成序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

在本发明提供的另一种优选实施方式中，所述生物材料包括表达载体；所述表达载体包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。