[发明专利]消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法

说明书

本发明公开了一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌；2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15‑30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50‑150mg/L的卡那霉素，0.05％‑1.0％的植物组培抗菌剂；3)将去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15‑30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20‑50mg/L的卡那霉素，2‑20mg/L的头孢噻肟钠；4)将无菌组培苗接入复壮培养基中培养20‑30天得到黄花蒿健康组培苗。本发明能够消除黄花蒿组织培养中的细菌污染，为种质保存及工厂化生产提供健康种源保证。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法。

背景技术

黄花蒿(Artemisia annua L.)又名青蒿、臭蒿、香蒿、苦蒿，为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia L.)一年生草本植物，是传统中药，具有清热解暑、除蒸、截疟的功效，早在公元340年东晋医药学家葛洪《肘后备急方》中就有记载。黄花蒿作为重要的药用植物，是一种宝贵的生物资源，其分布极其广泛，是世界广布种，但世界上青蒿素类药物的原料80％～90％来自中国。黄花篙基因型丰富，在自然条件下很难实现优良基因资源的人工保存及其繁殖利用。在天然黄花蒿植物中，青篙素含量普遍偏低，且不稳定，用大规模的自然或人工繁殖黄花篙来获得青篙素，不但会降低黄花篙的品质，破坏自然资源，不利于野生资源的保护而且还会受到自然条件的制约，而组织培养技术则可以克服以上问题，而且可以实现优良种质的长期保存。但实验过程中发现，在黄花蒿组培苗的继代与保存过程中，随着时间的推移，组培苗基部会遇到大量的细菌污染并产生恶性循环，严重时培养基表面出现白色或黄色水渗样物质，使污染的组培苗生长缓慢，既不增殖也不生根，甚至死亡，试验材料无法得到保存，并给后续试验及种苗推广带来巨大的损失，因此摸索消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，能显著降低甚至消除黄花蒿组织培养中的细菌污染，能为种质保存及工厂化生产提供健康种源保证。

为了实现本发明的目的和其它优点，提供了一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：

1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；

2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15-30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50-150mg/L的卡那霉素，0.05％-1.0％的植物组培抗菌剂；

3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15-30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20-50mg/L的卡那霉素，2-20mg/L的头孢噻肟钠；

4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养20-30天得到黄花蒿健康组培苗。

优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。

优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。

优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50-100mg/L卡那霉素、0.5-1g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以10-50rpm转速摇5-30分钟，然后以无菌水清洗3-5次。