[发明专利]一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用

说明书

本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用。该透明质酸酶突变体氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。本发明以肺炎链球菌Streptococcus pneumonia SP098的野生型透明质酸酶hyl为基础，选择第110位、第409位、第519位、第525位和第532位的氨基酸进行迭代饱和突变。与野生型透明质酸酶hyl相比，透明质酸酶突变体hyl‑E110K‑W409C‑D532P‑N519W‑A525G的酶活力提高了3.73倍，达到21.3×10⁵U/mL，应用该透明质酸酶突变体进行寡聚透明质酸的生产，最高发酵产量可以达到50.5g/L。

技术领域

本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

HA寡聚糖广泛应用于化妆品、医药及临床诊治、食品行业中，市场需求度高；常规HA制备方法得到透明质酸分子量较大，物理法和化学法水解获得寡糖过程随机，增加生产成本，影响产品收率，酶解法最适于制备寡聚透明质酸。微生物成为工业酶制剂的主要来源。但目前缺乏能够表达酶活高、热稳定性和pH稳定性好稳定的外源表达载体，同时寡聚糖的制备工艺尚处在优化与改进的阶段，获得、分离与纯化单一聚合度的寡聚透明质酸所需的凝胶材料造价太高，为工业化生产带来困难。

中国专利文献CN106636036A公开了一种透明质酸酶突变体及其应用。该发明将透明质酸酶突变体采用食品级安全的工业菌株枯草芽孢杆菌进行表达，获得了透明质酸酶生产菌株。以该重组枯草芽孢杆菌发酵，可在发酵上清液中收集得到透明质酸酶，该酶在pH4～9的范围内保持很好的活性，相比突变前，在耐酸性能上有了提高，温度25～40℃条件下保持良好活性，且耐受低温性能有显著提高。但是该专利得到的透明质酸酶突变体在偏酸偏热的环境中，对酶活的影响浮动很大，在应用于生产中存在明显不足。

中国专利文献CN111971387A公开了一种透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合，该发明涉及透明质酸酶PH20突变体或其片段，改善酶的热稳定性及酶活性。中国专利文献CN113444708A公开了一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，该发明对人透明质酸酶PH20进行定点突变，根据特定位点在透明质酸二级结构预测的分布位置，和这些位点氨基酸的性质，最终确定突变序列及活性分析，得到了四个无糖基化修饰切保留催化活性的透明质酸酶突变体，有利于药物在皮下组织扩散。这两篇专利方法得到的透明质酸酶突变体更多应用于药物，并未见应用于寡聚透明质酸的生产，且改造的基因序列来源皆为PH20，具有一定的限制性。

发明内容

本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用。该酶能够应用于制备寡聚透明质酸过程中，可降低大规模生产制备纯化透明质酸酶及寡糖的成本，创造更大的经济效益，满足市场需求，减少环境污染。

本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种透明质酸酶突变体，其氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。

根据本发明优选的，所述透明质酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其次，本发明提供所述的透明质酸酶突变体的编码基因。

根据本发明优选地，所述透明质酸酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。