[发明专利]一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法

权利要求书

1.一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；

所述突变的点位为：Y135A、Y135I、T181A、T181I、Q387A、Q387I、D392A、D392I、和T194I中的一个或多个组合。

2.一种表达权利要求1所述突变蛋白的重组菌。

3.根据权利要求2所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

4.根据权利要求2或3重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP-PLD2，其中载体为质粒pBADKP，宿主细胞为E.coli TOP10，具体构建方法见专利CN109136207B；

(2)利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP-PLD2中提取含有SEQID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP，将质粒pBADKP作为突变PCR的模板；

(3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增，得到扩增产物；

(4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA，得到消化产物；

(5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对Y135A点突的突变引物Y135A-F和Y135A-R，所述Y135A-F的核苷酸序列如包括SEQ IDNO.2所示，所述Y135A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

针对Y135I点突的突变引物Y135I-F和Y135I-R，所述Y135I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.4所示，所述Y135I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

针对T181A点突的突变引物T181A-F和T181A-R，所述T181A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.6所示，所述T181A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

针对T181I点突的突变引物T181I-F和T181L-R，所述T181I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.8所示，所述T181I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

针对Q387A点突的突变引物Q387A-F和Q387A-R，所述Q387A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.10所示，所述Q387A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

针对Q387I点突的突变引物Q387I-F和Q387I-R，所述Q387I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.12所示，所述Q387I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

针对D392A点突的突变引物D392A-F和D392A-R，所述D392A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.14所示，所述D392A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

针对D392I点突的突变引物D392I-F和D392I-R，所述D392I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.16所示，所述D392I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

针对D194I点突的突变引物D194I-F和D194I-R，所述D194I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.18所示，所述D194I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)所述PCR扩增程序包括：98℃预变性5min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，72℃延伸2min，以1min/kb进行延伸，30循环；72℃延伸10min；4℃保持。

7.一种利用权利要求4所述磷脂酶D表达重组菌制备磷脂酶D的方法，其特征在于：所述磷脂酶D表达重组菌用LB培养基复苏后，转接于TB培养基中培养5-6h，再转接至TB调整培养基中，加入诱导剂，诱导磷脂酶D的表达。