[发明专利]一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法

权利要求书

1.一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；

所述突变的点位为：G381M、A122M、A122L或R377M。

2.一种表达权利要求1所述突变蛋白的重组菌。

3.根据权利要求2所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

4.根据权利要求2或3重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP-PLD2，其中载体为质粒pBADKP，宿主细胞为E.coli TOP10，具体构建方法见专利CN109136207B；

(2)利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP-PLD2中提取含有SEQID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP，将质粒pBADKP作为突变PCR的模板；

(3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增，得到扩增产物；

(4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA，得到消化产物；

(5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对G381M点突的突变引物G381M-F和G381M-R，所述G381M-F的核苷酸序列如包括SEQ IDNO.2所示，所述G381M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

针对A122M点突的突变引物A122M-F和D175L-R，所述A122M-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.4所示，所述A122M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

针对A122L点突的突变引物A122L-F和A122L-R，所述A122L-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.6所示，所述A122L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

针对R377M点突的突变引物R377M-F和R377M-R，所述R377M-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.8所示，所述R377M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)培养野生型E.coliTOP10/pBADKP-PLD2具体步骤包括：取培E.coli TOP10/pBADKP-PLD2冰冻菌液利用LB培养基于37℃，200rpm条件下培养12h。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述LB培养基为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)具体步骤为：加入2μL的DpnⅠ于37℃反应1.5h消化未突变的模板DNA，得到消化产物。

9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)所述PCR扩增程序包括：98℃预变性5min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，72℃延伸2min，以1min/kb进行延伸，30循环；72℃延伸10min；4℃保持。

10.一种利用权利要求4所述磷脂酶D表达重组菌制备磷脂酶D的方法，其特征在于：所述磷脂酶D表达重组菌用LB培养基复苏后，转接于TB培养基中培养5-6h，再转接至TB调整培养基中，加入诱导剂，诱导磷脂酶D的表达。