[发明专利]一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法

说明书

本发明提出了一种CAR‑NK细胞保存液及其制备方法、保存方法，包括以下成分：无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白；所述氨基酸为L‑谷氨酰胺、L‑亮氨酸、L‑苏氨酸、L‑门冬氨酸中的至少一种；所述维生素B为维生素B2和/或维生素B6。本发明制备获得的CAR‑NK细胞保存液，60h后CAR‑NK细胞活率均维持在91％以上，在150h后CAR‑NK细胞活率均维持在83％以上，本发明的CAR‑NK细胞保存液，可有效延长CAR‑NK细胞的保存时间，维持CAR‑NK细胞的活力，能够较好地保证CAR‑NK细胞体外保存情况下，对肿瘤细胞仍具有较好的杀伤功能表达。

技术领域

本发明涉及细胞保存液技术领域，特别涉及一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural kllr ell,NK cell)，是机体重要的免疫细胞，是人体非特异性免疫功能的一类颗粒淋巴细胞群，通过分泌多种细胞因子，起到杀伤靶细胞的作用。近年来，出现了NK细胞用于治疗多种肿瘤疾病的研究热点。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy,CAR-T疗法)，是一种治疗肿瘤靶细胞的疗法，已有两种CAR-T产品用于临床治疗。CAR-T疗法的原材料为患者自体T细胞，经过激活、改造成CAR-T细胞，通过靶向识别体内肿瘤细胞，并释放更多的效应因子，达到针对性地杀灭肿瘤细胞，有效治疗恶性肿瘤。但CAR-T的制备过程较为繁琐，周期也较长，且可能会出现移植物抗宿主病等风险。鉴于CAR-T疗法的局限性，目前，研究人员致力于使用CAR-NK用于治疗难治性的肿瘤疾病。

在可提高CAR-NK细胞活性，维持其杀伤活性，并避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题的细胞保存液中，进行有效保存CAR-NK细胞，是有效提高CAR-NK细胞用于细胞疗法的重要因素。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法，可提高CAR-NK细胞活性，维持其杀伤活性，并避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题，有效保存CAR-NK细胞，提高CAR-NK细胞用于治疗肿瘤疾病的细胞疗法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种CAR-NK细胞保存液，包括以下成分：无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白；

所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-门冬氨酸中的至少一种；

所述维生素B为维生素B2和/或维生素B6；

无患子皂苷、桑黄酮可减轻CAR-NK细胞的损失程度，减少炎性细胞因子的产生，延长CAR-NK细胞的存活时间，并改善保护液组分的渗透，改善CAR-NK细胞的保护作用，提高CAR-NK细胞的活性。

进一步说明，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、5-15mg/L氨基酸、5-8mg/L维生素B、10-18μmol/L辅酶Q10、30-50mg/mL无患子皂苷、50-70mg/L桑黄酮和0.4-0.8mg/L人血清白蛋白。

更进一步说明，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、8-12mg/L氨基酸、6-7mg/L维生素B、10-12μmol/L辅酶Q10、40-45mg/mL无患子皂苷、50-55mg/L桑黄酮和0.4-0.6mg/L人血清白蛋白。

进一步说明，所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和L-门冬氨酸的用量比为1：1-2：1-2；所述维生素B为维生素B2。

更进一步说明，还包括PGE2(前列腺素E2)和糖萜素；每1mL的CAR-NK细胞保存液中加入20-32μg所述PGE2和0.5-0.6μg所述糖萜素。