[发明专利]O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒，其特征在于，所述的O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒是由重组蛋白SPC-B4T和2STAP205通过体外自组装后得到；

其中，所述的重组蛋白SPC-B4T是将SpyCatcher、O型4个拓扑型的代表毒株O/Tibet/CHA/99、O/Mya98、O/HN/CHA/93、O/XJPS/CHA/2017的抗原表位和3A的T细胞表位依次顺序串联，相邻抗原表位间引入间隔子序列GS，在SpyCatcher基因与O/Tibet/CHA/99抗原表位基因间引入间隔子序列GGGGSGGGGS得到的，连接顺序为SpyCatcher-O/Tibet/CHA/99-O/Mya98-O/HN/CHA/93-O/XJPS/CHA/2017-3A；

其中，所述的重组蛋白2STAP205是将SpyTag的基因分别通过柔性间隔子GSGTAGGGSGS以及GGSGGSG连接在噬菌体AP205基因的两端得到的，连接顺序为SpyTag-GSGTAGGGSGS-AP205-GGSGGSG-SpyTag。

2.如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒，其特征在于，所述的重组蛋白SPC-B4T的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的重组蛋白2STAP205的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种制备权利要求1或2所述的O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)SpyCatcher与O型口蹄疫病毒多表位基因嵌合DNA的合成

将SpyCatcher、O/Tibet/CHA/99、O/Mya98、O/HN/CHA/93、O/XJPS/CHA/2017的抗原表位和3A的T细胞表位依次顺序串联，相邻抗原表位间引入间隔子序列GS，而在SpyCatcher基因与O/Tibet/CHA/99抗原表位基因间引入GGGGSGGGGS，即为设计的嵌合DNA：SpyCatcher-O/Tibet/CHA/99-O/Mya98-O/HN/CHA/93-O/XJPS/CHA/2017-3A，利用生物软件对嵌合DNA基因进行密码子偏好性优化，并在基因的5′-和3′-端引入BamH1和Xho1特异性酶切位点，命名为SPC-B4T，优化后的嵌合DNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)SpyTag-噬菌体AP205嵌合基因的合成

将SpyTag的基因分别通过柔性间隔子GSGTAGGGSGS以及GGSGGSG连接在噬菌体AP205基因的两端，形成SpyTag-GSGTAGGGSGS-AP205-GGSGGSG-SpyTag结构，利用生物软件对嵌合基因进行密码子偏好性优化，并在基因的5′-和3′-端引入BamH1和Xho1特异性酶切位点，命名为2×SpyTag/AP205，优化后的嵌合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

(3)基因克隆及其重组蛋白表达，纯化

将SPC-B4T、2×SpyTag/AP205和pET-28a(+)分别用BamH1和Xhol酶切，纯化回收，然后将其分别插入用相同酶线性化pET-28a(+)，构建重组表达质粒pET-28/SPC-B4T，pET-28/2×SpyTag/AP205，并转化JM109感受态，通过抗性筛选、双酶切和序列分析鉴定阳性重组表达质粒；

将上述2种阳性重组表达质粒分别采用热激发转化BL21(DE3)pLysS，挑选单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1％(V/V)加入新制备的无菌含卡那霉素的LB培养液中，于37℃培养箱220rmp培养至OD600nm≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG后于37℃诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，超声破碎，20000g离心20min收集上清，弃沉淀；按照Ni-NTA组氨酸纯化柱说明书纯化蛋白，纯化蛋白分别命名为SPC-B4T和2STAP205；

(4)O型口蹄疫病毒多表位仿生纳米自组装病毒样颗粒的组装

将上述亲和层析纯化获得的SPC-B4T和2STAP205蛋白，按质量比2-5:1混合，室温或4℃进行VLP组装，SPC-B4T和2STAP205蛋白通过自组装体系组装成仿生纳米抗原(VLP)。