[发明专利]一种寡核苷酸序列一致性的检测方法

说明书

本发明提供了一种寡核苷酸序列一致性的检测方法，所述方法包括：采用带有待检寡核苷酸序列的引物对对已知DNA序列片段进行扩增，得到扩增产物，对扩增产物直接进行测序，根据测序结果确认待检寡核苷酸的序列一致性。通过已知DNA序列进行数据拆分，可以准确、高通量的批量定性分析不同寡核苷酸序列的交叉污染情况和/或合成错误情况。

技术领域

本发明属于高通量基因测序领域，涉及一种质检寡核苷酸序列的方法。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generationsequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术可以对数百万个DNA分子同时进行测序，一次平行检测几百甚至上千个样本。在高通量测序中，需要采用大量的标签序来标记不同样本文库，以方便在高通量测序结果中区分不同样本序列。

在二代测序中，往往采用标签引物用于测序数据拆分的标签。每一个文库对应唯一的一个标签序列，才能保证拆分获得的测序数据中，文库间不存在交叉污染。但实际使用过程中发现，不同引物间，存在交叉污染(A引物中混入B引物)，导致不同文库数据间出现交叉污染；另外标签引物合成方法本身的局限性，导致标签引物中存在合成错误现象。若标签引物间存在高比例交叉污染，则可能会导致测序结果准确性下降，出现假阳性、假阴性数据结果报出，影响测序结果准确性。若标签引物中存在高比例合成错误，则会导致下机数据中，未拆分数据比例上升，导致测序成本的高比例上升。

对于NGS标签引物而言，现有技术中，引物合成公司多通过严格工艺流程来控制，将不同批次隔离生产的方式来降低引物间交叉污染的可能性。在质控方面多采用nanodrop浓度检测、毛细管电泳或质谱检测核苷酸数量的质量控制手段。但是其质控手段，不能有效的对NGS标签引物序列准确度进行标定，难以满足下游实验的实际质控和测序测序需求。

发明内容

针对现有技术的不足和实际生产实验需求，本发明提供了一种质检寡核苷酸序列的方法，采用一端与待测寡核苷酸互补的已知寡核苷酸序列作为已知DNA序列与待测寡核苷酸发生PCR扩增反应，扩增产物进行二代测序，通过已知DNA序列进行数据拆分，分析不同寡核苷酸序列的交叉污染情况和/或合成错误情况。

具体的，本发明采用如下技术方案：

1.一种寡核苷酸序列一致性的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

采用带有待检寡核苷酸序列的引物对，对已知序列DNA片段的进行扩增；

得到扩增产物，对扩增产物直接上机进行测序，获得测序数据；

根据测序数据确认待检寡核苷酸的序列一致性；

其中，所述引物对包括正链引物序列和反链引物序列，所述的两条引物序列，3’端序列分别带有与所述已知序列DNA片段的3’端特异性识别的互补序列；所述的寡核苷酸序列存在于正链引物序列或反链引物序列中任一条序列上，位于所述的5’端序列与3’端序列之间；

其中，一对带有待检寡核苷酸序列的引物对应一条已知序列DNA片段。

2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述已知序列DNA片段包含一段序列已知的非天然寡核苷酸片段，其特征在于所述非天然寡核苷酸片段与现有任一已知物种基因组上任意位置序列完全不同源。

3.根据项1中所述的方法，其特征在于，所述的两条引物序列的5’端序列分别带有与测序平台互补配对的接头序列。

4.根据项1所述的方法，其特征在于，所述待检寡核苷酸的序列一致性是指，所述待检测寡核苷酸序列测得序列与其设计时序列一致和/或所述测序数据中仅含有单一序列数据结果。