[发明专利]一种烟酰胺核糖激酶突变体的应用

说明书

本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种烟酰胺核糖激酶突变体的应用，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，在该烟酰胺核糖激酶突变体存在下，可在45℃‑50℃高温条件下将烟酰胺核糖生成烟酰胺单核苷酸。本发明的烟酰胺核糖激酶突变体高温催化烟酰胺核糖生成烟酰胺单核苷酸，反应温度更高，可有效缩短反应时间，并有效灭活杂酶，减少产物的降解。

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种烟酰胺核糖激酶突变体的应用。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种重要的天然化合物，在生物体中广泛存在。NMN作为NAD和NADP的直接前体引起了广泛关注，NMN可以为现代疗法开辟新的视野。该生物分子已经证明在几个临床前疾病模型中具有许多有益的药理活性，包括心脑缺血、神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和糖尿病。在鼠模型中，其抗衰老、延长寿命特性的最新发现使NMN作为潜在的治疗候选物更具吸引力。它的大部分药理作用是通过促进NAD的合成而发生的，因为以较高剂量直接施用NAD有时会出现诸如失眠、疲劳和焦虑之类的副作用，并且与NMN相比，它穿透质膜的能力较差。

目前，NMN的主要生产工艺有如下几种：(1)化学合成法。因涉及引起基因畸变的原料，市场接受度较低；(2)ATP提供磷酸供体的方式，因ATP只能使用一个循环，原料单耗过高，随着产品价格的大幅下降目前已不具有实用意义；(3)乙酰磷酸循环ATP的方式，通过ATP提供磷酸基团；(4)多聚磷酸循环ATP的方式；(5)发酵法，发酵浓度低，杂质多，分离成本过高，产品品质较差造成市场上接受度较低。

乙酰磷酸做为第一代的磷酸供体用于ATP循环反应，已有40余年的历史。如日本大赛璐化学在1985发表的专利US4753757 Process for preparing solid acetylphosphate salt公布了乙酰磷酸锂盐制备方法。Crans等在1983年公布了一种乙酰磷酸的合成方法(A convenient synthesis ofdisodium acetyl phosphate for use in in-situ ATP cofactor regeneration)。但由于其环境不友好，目前基本不会再被工业上大规模采用。由于乙酰磷酸不会对生物酶有大的抑制，故采用高浓度的乙酰磷酸做为磷酸供体不会对体系有副面影响，因此使得产物浓度可以做到相对很高；且由于其磷酸键相对高能使得反应向下游进行更加彻底，很少出现底物残留。这是乙酰磷酸最大的两个优势，但由于乙酰磷酸的制备过程涉及易制毒原料乙酸酐，乙酰基做为副产物被浪费掉使得利用率低且成品极不稳定很难持续批量生产做为稳定原料，而其生产成本进一步决定了只能用于高附加值产品的磷酸化反应。而NMN的公斤级价格突破500元已成必然，故所有使用昂贵底物的生产工艺如乙酰磷酸等不再能满足工业化需求。

CN110373398在2019年首次公布了Kluyveromyces marxianus来源的烟酰胺核糖激酶在NMN制备中的应用，其配合大肠杆菌来源的PPK2，以多聚磷酸为磷酸供体，最终实现5％底物浓度，转化率80％，是目前较优秀的生产方案。但仍然存在底物浓度低转化率不高等缺点。Qian等2022年同样使用了从Kluyveromyces marxianus来源的烟酰胺核糖激酶，配合嗜热硬脂芽孢杆菌的乙酰激酶，使用乙酰磷酸循环ATP的方式来制备NMN，100g/L的NR在8h内可完全磷酸化为NMN，摩尔收率达到84.2％。同样由于乙酰磷酸的参与使得此工艺竞争力不强(Qian,XL.,Dai,YS.,Li,CX.et al.Enzymatic synthesis of high-titernicotinamide mononucleotide with a new nicotinamide riboside kinase and anefficient ATP regeneration system.Bioresour.Bioprocess.9,26.2022)。

因此，寻找一种热稳定更好的烟酰胺核糖激酶突变体制备烟酰胺单核苷酸成为了本领域亟需解决的问题之一。

发明内容