[发明专利]一种消减三七自毒物质微生物菌种的筛选方法

说明书

本发明公开了一种消减三七自毒物质微生物菌种的筛选方法：(1)样品采集；(2)菌种驯化：根际土壤加入含有苯甲酸的MSM液体培养基中，恒温培养富集，此后每7‑8d取上一次的菌液转接到新的MSM液体培养基中，并逐步提高MSM液体培养基中苯甲酸的浓度，依次提高MSM液体培养基中苯甲酸的浓度，进行驯化培养；(3)菌种分离筛选。本发明利用微生物消减三七的自毒物质为缓解或克服三七的连作障碍提供了一种新技术，具有成本低，适应性强，有效期长，消减率高等优点；将筛选出的菌株接种于三七连作土壤，能明显促进三七生长，所筛选的菌株可用于作物连作障碍缓解或环境修复。

技术领域

本发明涉微生物筛选技术领域，具体涉及一种消减三七自毒物质微生物菌种的筛选方法。

背景技术

三七是我国传统名贵中药材，目前三七连作障碍严重影响了三七的药材产量和品质，是三七产业发展的瓶颈之一。连作障碍的成因包括土壤的传染性病害、理化性状劣变等。植物化根系分泌物介导下植物-土壤-微生物互作是三七连作障碍形成的关键因素之一，自毒作用是其中一种表现形式。自毒作用是指植物通过淋溶、挥发、根系分泌和植物残体降解等途径释放某些生物活性物质到环境之中，并对自身的生长发育产生抑制作用。

三七，主要依靠轮作来缓解连作障碍的发生，但是轮作年限往往需要8-10年，这种方法效率低下，因此迫切需要开发替代的可持续技术。相比之下生物降解的处理方法更加合理，对环境污染小，符合可持续发展的理念。研究证明，微生物对降解土壤中积累的自毒物质有较好的效果。尽管已经发现了一些有机污染物的降解的细菌，但大量的微生物资源值得进一步探索，其筛选方法的科学性、有效性、高效性显得尤为重要。建立筛选方法，筛选自毒物质消减菌对有效环保的解决连作障碍问题或土壤污染严重问题具有重大的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种消减三七自毒物质微生物菌种的筛选方法，旨在得到一种成本低、适应性强、有效期长、消减率高的筛选方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种消减三七自毒物质微生物菌种的筛选方法，包含以下操作步骤：

(1)样品采集：选择三年生及其以上健康三七，用铁铲小心地将植株连根挖出，抖落根围土壤，用刷子轻刷根系收集根际土壤；

(2)菌种驯化：根际土壤加入含有苯甲酸的MSM液体培养基中，恒温培养富集，此后每7-8d取上一次的菌液转接到新的MSM液体培养基中，并逐步提高MSM液体培养基中苯甲酸的浓度，依次提高MSM液体培养基中苯甲酸的浓度，进行驯化培养；所述的含有苯甲酸的MSM液体培养基为向所得MSM液体培养基中加入碳源苯甲酸，并控制苯甲酸在MSM液体培养基中的浓度为50-200mg/L；

(3)菌种分离筛选：在超净台中取最后一次富集菌液100μL，用无菌水采用十倍稀释法稀释成10^-3至10^-9不等的菌悬液，将悬浮液采用划线接种分别接种在LB固体培养基中培养1-2天；挑取不同形态的微生物单菌落纯化培养，将纯化的菌落移接于LB固体培养基中冷藏保存，即得消减三七自毒物质微生物菌种。

其中，步骤(2)中根际土壤加入含有50mg/L苯甲酸的MSM液体培养基中，恒温培养富集。

其中，步骤(2)中所述的MSM液体培养基组分为(NH₄)SO₄ 1.0g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄1.5g、NaCl 1.0g和MgSO₄·7H₂O 0.1g；将上述各组分溶解于1L去离子水中，调节pH至7，即为MSM液体培养基。

其中，步骤(2)中所述的恒温培养为30℃，180r/min的恒温培养振荡器中培养7d富集。