[发明专利]用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统及其构建与应用

权利要求书

1.一种用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统，其特征在于，包括编辑载体pTN-Cas9，以及编辑载体pTK-GFP-CotB、pTC-RFP-CgeA中的任意一种或者多种，其序列分别为SEQ ID NO.1-3所示。

2.根据权利要求1所述的用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统，其特征在于，所述编辑载体pTN-Cas9以pTN为基础载体插入了Cas9蛋白表达框；所述Cas9蛋白表达框包括p43启动子、Cas9蛋白编码基因和t1t2终止子，所述Cas9蛋白表达框的序列SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统，其特征在于，所述编辑载体pTK-GFP-CotB以pTK为基础载体，插入p43-sgRNA1表达框表达框、编码绿色荧光标记蛋白(GFP)以及孢子表面蛋白BvCotB基因；所述p43-sgRNA1表达框表达框包括p43启动子和sgRNA1序列，p43-sgRNA1表达框表达框其序列如SEQ ID NO.5所示；所述编码绿色荧光标记蛋白(GFP)基因其序列如SEQ ID NO.6所示；所述编码孢子表面蛋白BvCotB基因其序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述的用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统，其特征在于，所述编辑载体pTC-RFP-CgeA以pTC为基础载体，依次插入p43-sgRNA2表达框、编码红色荧光标记蛋白(RFP)以及孢子表面蛋白BvCgeA基因；所述p43-sgRNA2表达框包括p43启动子和sgRNA2序列，p43-sgRNA2表达框其序列如SEQ ID NO.8所示；所述编码红色荧光标记蛋白(RFP)基因其序列如SEQ ID NO.9所示；所述编码孢子表面蛋白BvCgeA基因其序列如SEQ ID NO.10所示。

5.一种权利要求1所述的用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统的构建方法，其特征在于，优选包括如下步骤：

(1)根据芽孢杆菌密码子偏好性优化Cas9蛋白序列，合成p43启动子及Cas9蛋白编码基因得到Cas9蛋白表达框并插入pTN载体，构建编辑载体pTN-Cas9；

(2)设计并合成符合贝莱斯芽孢杆菌密码子偏好性的sgRNA1表达框，以孢子表面蛋白BvCotB为靶位点，绿色荧光蛋白为重组表达蛋白设计并合成用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgRNA1表达框和同源重组片段依次通过酶切和酶连接克隆至pTK载体多克隆位点，获得所述基因编辑载体pTK-GFP-CotB；

(3)设计并合成符合贝莱斯芽孢杆菌2密码子偏好性的sgRNA2表达框；以孢子表面蛋白BvCgeA为靶位点，红色荧光蛋白为重组表达蛋白设计并合成用于贝莱斯芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgRNA2表达框和同源重组片段依次通过酶切和酶连接克隆至pTC多克隆位点，获得所述基因编辑载体pTC-RFP-CgeA。

6.一种权利要求1所述的用于贝莱斯芽孢杆菌HCK2孢子表面表达的三质粒基因组编辑系统在贝莱斯芽孢杆菌基因组编辑、孢子表面表达异源蛋白或多肽中的应用。