[发明专利]一类对硝基苯胺类化合物的制备方法

说明书

本发明提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法。本发明提供的合成方法以原料氨基酸与对硝基苯胺的酰胺化为第一步工艺方案，然后根据需要对氨基酸进行肽链延伸，得到二肽、三肽等对硝基苯胺类发色底物，具备反应收率高、底物纯度高、且对氨基酸对硝基苯胺类底物合成具备一定应用普遍性，可实现大批量生产等技术优势。本发明提供的制备方法能够制备一类对硝基苯胺类化合物，其显色效果佳，可满足科学研究及体外诊断领域中酶活性检测应用需求。

技术领域

本发明属于氨基酸对硝基苯胺类化合物合成技术领域，涉及一类对硝基苯胺类化合物的制备方法，尤其涉及氨基酸类对硝基苯胺的制备方法。

背景技术

对硝基苯胺显色底物是研究蛋白酶动力学和筛选酶抑制剂的一类重要生化试剂，其经过特定酶水解产生的游离对硝基苯胺在405nm波长具有明显吸收峰，且具有整个过程中所需的显色试剂用量少、灵敏度高、稳定性好等优点，因此在科学研究及体外诊断领域得到广泛应用。

该类显色底物中最常用的有L-吡咯烷酮酰对硝基苯胺、L-亮氨酸对硝基苯胺、L-精氨酸对硝基苯胺、丙氨酰-苯丙氨酰-脯氨酸对硝基苯胺、焦谷氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸对硝基苯胺、BOC-亮氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐等氨基酸对硝基苯胺类底物。

但由于发色体对硝基苯胺结构中氨基对位硝基的强吸电子作用的大幅降低了氨基的亲核性，导致上述底物合成过程中采用经典的多肽合成缩合剂进行对硝基苯胺的酰胺化非常困难，且很少有文献对该类底物的合成方法进行报道。

目前已有报道中采用DCC、EDCI、HATU等缩合剂或酸酐法直接缩合效率都很低，甚至采用剧毒的氯甲酸乙酯进行工艺改进的效果依旧不甚理想，报道常见收率多介于0～30％之间，不利于该类底物的扩大生产。再如，专利CN102936207提供了一种通过三氯氧磷法制备L-亮氨酸对硝基苯胺的方法，收率可达到80％左右，但由于多数氨基酸对三氯氧磷、二氯亚砜等酰卤化试剂较为敏感，故该方法应用局限性较大。

因此，如何找到一种更为适宜的氨基酸对硝基苯胺类化合物的制备路线，解决现有技术中存在的上述问题，更加有利于工业化的推广和应用，一直是业内诸多一线研究人员广为关注的焦点之一。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一类对硝基苯胺类化合物的制备方法，特别是一类氨基酸类对硝基苯胺的制备方法。本发明提供的制备方法针对对氨基酸对硝基苯胺类化合物适用性强，所得目标物纯度高，收率高，工艺简单，可控性强，更加有利于工业化生产扩大化的推广和应用。

本发明提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤：

1)将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；

2)将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)、2)和3)，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。

优选的，所述步骤1)中，BOC-氨基酸包括BOC-吡咯烷酮酸、BOC-L-亮氨酸、BOC-L-脯氨酸或BOC-L-精氨酸；

所述步骤1)中，对硝基苯胺与BOC-氨基酸的摩尔比为1：1；

所述步骤1)中，对硝基苯胺与六氯三聚磷腈的摩尔比为1：(0.35～0.65)。