[发明专利]一种可用于合成靶向抗肿瘤药物的氨甲酰美登醇及其合成方法与应用

权利要求书

1.一种可用于合成靶向抗肿瘤药物的氨甲酰美登醇，其特征在于，其化学结构如下所示：

2.如权利要求1所述氨甲酰美登醇的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将能够表达氨甲酰基转移酶基因asc21b和正调控因子基因ascR4的基因工程菌HGF052+pSET5035n-ascR4-asc21b在ISP4固体培养基上划线活化，于30℃下培养3～5天，得到活化好的菌种；

(2)挑取活化好的菌种接种到YMG固体培养基上，于28～30℃下发酵培养9～12天，得到固体培养物；

(3)将固体培养物取出，切成1cm³的小方块，在20～30℃下用体积比为80:15:5的乙酸乙酯/甲醇/甲酸浸泡提取18～24小时，合并提取液，减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得粗提物；再重复2～3次，合并粗提物；

(4)将粗提物溶于400～500mL纯净水中，使用等体积乙酸乙酯萃取2～4次，得到乙酸乙酯相；再将乙酸乙酯相减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得EA提取物；

(5)将EA提取物溶于200～300mL甲醇中，再经等体积石油醚多次萃取，得到甲醇相；甲醇相减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得甲醇提取物；

(6)将甲醇提取物依次经反相硅胶柱层析分离，凝胶柱层析分离，薄层层析和高效液相色谱分离，然后将组分相同的洗脱液进行合并，得到氨甲酰美登醇。

3.如权利要求2所述氨甲酰美登醇的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因工程菌HGF052+pSET5035n-ascR4-asc21b的构建方法，包括步骤如下：

(a)以asc基因簇DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到正调控因子基因ascR4序列，PCR引物序列如下：

ascR4-F:5′-AAAGGAGGCGGACATATGCTGGACATCATCGGCCTGAGTG-3′，

ascR4-R:5′-CAATTGCCTCTAGATCACGGATGTGCCGAAGGCGAACCCG-3′；

(b)将步骤(a)中所述正调控因子基因ascR4序列插入到整合型表达载体pSET5035n上的Ned I和Xba I限制性酶切位点之间，使正调控因子基因ascR4位于kasop启动子的下游并受其调控，得到质粒载体pSET5035n-ascR4；

(c)以pSBT11-asc21b载体为模板进行PCR扩增，扩增得到带有ermE*p启动子的氨甲酰基转移酶基因asc21b序列(ermE*p-asc21b)，PCR引物序列如下：

asc21b-F:5′-GGCAATTGGGAATTCGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCT-3′，

asc21b-R:5′-TACAAAGATCGGAATTCAGGCCGGAGTGAGGGTGAAGAAG-3′；

(d)将步骤(c)中所述ermE*p-asc21b序列插入到质粒载体pSET5035n-ascR4的EcoRI限制性酶切位点，得到质粒载体pSET5035n-ascR4-asc21b；

(e)将质粒载体pSET5035n-ascR4-asc21b转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，获得大肠杆菌-放线菌接合转移供体菌ET12567/pUZ8002/pSET5035n-ascR4-asc21b；

(f)将供体菌ET12567/pUZ8002/pSET5035n-ascR4-asc21b与珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052的菌丝体进行接合转移，得到基因工程菌HGF052+pSET5035n-ascR4-asc21b。

4.如权利要求3所述氨甲酰美登醇的合成方法，其特征在于，步骤(a)中，所述正调控因子基因ascR4基因库登记号为KF813023.1，所述基因ascR4的开放阅读框序列如SEQ IDNO.1所示；所述整合型表达载体pSET5035n的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求3所述氨甲酰美登醇的合成方法，其特征在于，步骤(c)中，所述带有ermE*p启动子的氨甲酰基转移酶基因asc21b序列如SEQ ID NO.2所示。