[发明专利]一种dsRNA在免疫缺陷中华蜜蜂模型构建中的应用

说明书

本发明公开了一种dsRNA的新用途，即其在免疫缺陷中华蜜蜂模型构建中的应用，dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明通过体外合成Spz4基因的部分片段的dsRNA，再给中华蜜蜂喂食dsRNA 72h后，即得免疫缺陷的中华蜜蜂模型，喂食dsRNA的免疫缺陷蜜蜂，Spz4基因的表达量降低70%，同时在致病菌侵染实验中7天的死亡率相比野生型蜜蜂增加了60%以上；且在粪肠球菌感染24小时后，4种抗菌肽的表达量显著降低。

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，具体的说，涉及一种dsRNA在免疫缺陷中华蜜蜂模型构建中的应用。

背景技术

免疫缺陷动物（immunodeficient animal）是指由于先天性基因突变或使用人工方法而导致免疫系统一种或多种成分缺陷的动物，可以利用免疫缺陷型的中华蜜蜂模型，对研究致病菌，寄生虫等致病机理有着极大的作用，从而可以达到有针对性的防治蜜蜂疾病的目的。

目前，在构建蜜蜂的免疫缺陷模型中，主要有两种技术方法，分别是CRISPR/Cas9和RNAi的方法。CRISPR/Cas9可使基因功能丧失更彻底，但是其操作复杂，耗时长，成本高。RNAi方法不能使基因的功能完全丧失，但可以大幅度降低目标基因的表达，且操作简单，耗时少，成本相对较低。RNAi是由双链RNA（dsRNA）诱导内源性特异性基因转录后沉默的一种机制。dsRNA进入生物体后，在细胞中被Dicer酶的RNaseⅢ分解为21-23bp的小干扰RNA（siRNA）。siRNA在沉默复合物（RISC）的作用下与靶mRNA结合，从而使其降解，达到降低基因表达水平的目的。

发明内容

本发明提供了一种dsRNA的新用途，即其在免疫缺陷中华蜜蜂模型构建中的应用，dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明通过体外合成Spz4基因的部分片段的dsRNA，再给中华蜜蜂喂食dsRNA 72h后，即得到免疫缺陷的中华蜜蜂。

本发明采用RNAi的方法构建中华蜜蜂的免疫缺陷模型，RNAi的靶基因为Spaetzle4（Spz4，Gene ID: 108002210），Spz4蛋白是Toll信号转导途径所必需的胞外蛋白，与Toll受体结合并激活通路，产生抗菌肽以抵抗病原体，因此我们通过RNAi沉默Spz4基因从而构建免疫缺陷的蜜蜂模型。

本发明免疫缺陷中华蜜蜂模型的构建方法如下步：

（1）提取中华蜜蜂的总RNA，反转录获取cDNA；以cDNA作为模板，使用引物Spz4F：CAACGAATTCAGGGACGAGG，Spz4R：AGTAGTGCCGGGGAAATTCA进行PCR，获得Spz4的第426-930位的基因片段；将Spz4基因片段与质粒载体pCE2连接后转化入大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆并提取质粒进行测序鉴定，将验证阳性的含有pCE2-Spz4RNAi质粒的大肠杆菌DH5α接种于含有卡纳霉素的LB液体培养基中进行增菌培养，抽提质粒，获得pCE2-Spz4RNAi质粒；

（2）以pCE2-Spz4RNAi质粒为模板，采用如下引物进行PCR扩增，获得用于扩增dsRNA序列的正向序列和反向序列，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，体外转录合成dsRNA；

Spz4F：CAACGAATTCAGGGACGAGG

T7+Spz4R：TAATACGACTCACTATAGGGAGTAGTGCCGGGGAAATTCA；

Spz4R：AGTAGTGCCGGGGAAATTCA

T7+Spz4F：TAATACGACTCACTATAGGGCAACGAATTCAGGGACGAGG；

（3）每日给中华蜜蜂喂食20μg的dsRNA，喂食72小时后，即得免疫缺陷型中华蜜蜂。