[发明专利]一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用，属于分子生物检测领域，包含以下步骤：1）胶体金纳米粒子的合成与修饰，2）四面体纳米结构探针的制备，3）试纸条的制备，该试纸条包含样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。该试纸条生物传感器在外泌体microRNA‑150‑5p的实际检测中表现出较高的灵敏度和巨大的应用潜力。因此，所发现验证的DNA纳米结构探针提供了一种在试纸平台上构建生物传感界面的通用方法，可应用与核酸标志物检测及细胞、外泌体、蛋白和小分子等非核酸标志物检测，具有优良的应用现场分析或床旁检测前景。所构建比率计试纸条为外泌体microRNA检测提供了一种POCT型检测新方法。

技术领域

本发明涉及分子生物传感技术领域，具体为一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用。

背景技术

侧流层析试纸条(Lateral flow test strips，LFTS)是一种重要的即时传感检测(point-of-care testing，POCT)平台。由于其便携性、可靠性、易用性、快速检测时间和成本效益的优越性，试纸条式传感器在当地诊所、家庭诊断、区域机场和偏远地区显示出巨大的潜力，供这些地区由未经培训的人员在仪器资源有限的情况下使用。除了最著名的家庭妊娠试验外，LFTS还被广泛用作肿瘤的快速检测、细菌、病毒和毒素等。特别是，LFTS作为目前最有前途的现场即时形式，在针对具有高度传染性的SARS-CoV 2病毒的快速诊断方面显示巨大应用价值。在这些传感策略中，常用的LFTS测定形式是基于抗体-抗原反应的夹心和竞争性测定，称为侧流免疫测定(lateral flow immunoassay，LFIA)。然而，在LFIA中使用抗体作为传感元件通常存在一些限制，包括生产成本高，生产时间长和热稳定性差。此外，针对非免疫原性或毒性靶标的抗体生产很困难。最近，研究人员试图采用基于核酸的传感策略作为替代方案。这种适配体(通过指数富集程序对配体的系统进化选择的独特核苷酸)代替抗体，用于检测非核酸靶标。同时，LFTS中已采用多种核酸扩增策略来灵检测与人类和环境健康有关的肿瘤和病原体的核酸和非核酸靶标。测试中使用的寡核苷酸具有高重现性、高稳定性和低生产成本的特点，并且易于用官能团修饰或定制，包括分裂、删除、取代、融合和伸长，从而在很大程度上解决了抗体依赖性侧流免疫测定中存在的局限性。在基于核酸的LFTS中，合成的寡核苷酸通常被设计为测试线和质控线上的条形码，用于识别捕获偶联物、生物识别元件或扩增元件。然而，条形码捕获探针需要提前与蛋白质分子连接形成蛋白-核酸复合物，以避免其随着样品流过而自我移动。即使用作识别或扩增元件，寡核苷酸也通常需要用至少一种功能分子修饰，以与固定在传感界面区的抗体或链霉亲和素发生反应。考虑识别捕获步骤时对，LFTS传感界面构建对抗体或其他蛋白分子的依赖性使得其应用不太实用或用户不友好性。从理论上讲，LFTS的多分析物检测能力受到在传感界面区作为捕获分子的抗体种类的限制。

DNA纳米技术是一种纳米级的自组装技术，使用DNA分子作为构建块和DNA可编程性，结合降低成本和提高DNA合成质量，使我们能够合理设计和精确控制核酸分子电路、机器和纳米结构。在DNA电路中，催化发夹组装(CHA)电路是一种有吸引力的等温扩增方法，用于体外诊断中目标靶标的无酶、高效和扩增检测，RNA成像(青等人，2021；Li等人，2022)或活细胞中其他核酸适体识别的分子的传感检测。通过引入触发序列，CHA电路通过一系列链位移反应进行发夹结构连续打开和组装的程序化过程，从而在短时间内实现基于CHA的等温信号放大。DNA四面体(DNAtetrahedron，DT)是由四个单链DNA组装的最简单的DNA多面体之一，最初由Turberfield及其同事报道。这种立体结构表现出卓越的特性，包括出色的寻址性、可控性、货物装载能力、生物相容性和稳定性。目前其已应用于电化学平台，用于检测核酸、蛋白质、小分子和细胞。进一步，DT已扩展到包括荧光检测在内的各种生物传感策略，电化学发光，晶体管传感器，光电化学生物传感器，细胞内成像，细胞膜监测，亚细胞蛋白分布的多重分析。