[发明专利]小鼠截短IL-36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用

权利要求书

1.小鼠截短IL-36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫调节药物包括调节炎症性肠病的药物。

3.小鼠截短IL-36γ蛋白在制备降低DSS诱导的肠炎易感性的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法为：

S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；

S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；

S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；

S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；

S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h～14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，进行诱导表达，离心后，得到菌体；

S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后离心，取上清液；

S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S2中所述PCR扩增的反应体系为：2×PfuMasterMix25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中所述LB培养基中的卡那霉素的浓度为50mg/L。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中离心的转速为4000rpm～5000rpm，离心的时间为5min～10min；

S6中离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心的时间为10min～20min。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S6中超声裂解的反应条件为：在功率为150W～200W的条件下，超声3s～5s，然后停止3s～5s，循环进行，共计进行45min～50min。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S7中纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。