[发明专利]一株新型重组卡介苗菌株的构建及其应用在审
| 申请号： | 202310029718.2 | 申请日： | 2023-01-09 |
| 公开（公告）号： | CN116286573A | 公开（公告）日： | 2023-06-23 |
| 发明（设计）人： | 李伟辉;王坤;崔旭杰;郑家琛;刘璐;粟智 | 申请（专利权）人： | 广西大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;A61K39/04;A61P31/06;C12N15/74;C12N15/31;C12N15/70;C12R1/32;C12R1/19 |
| 代理公司： | 广西中知华誉知识产权代理有限公司 45140 | 代理人： | 牙斐颖 |
| 地址： | 530005 广西壮族*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 新型 重组 卡介苗 菌株 构建 及其 应用 | ||
1.一株新型重组卡介苗菌株其特征在于，由野生型BCG菌株Pasteur1173P2敲除bcg_0819c基因获得，所述bcg_0819c基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.一种构建如权利要求1所述一株新型重组卡介苗菌株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以Pasteur1173P2菌株为模板，以bcg_0819c-up-PacI-F/bcg_0819c-up-SpeI-R引物对扩增出bcg_0819c基因上游1000bp片段；所述bcg_0819c-up-PacI-F引物序列如SEQ IDNO:2所示，所述bcg_0819c-up-SpeI-R引物序列如SEQ ID NO:3所示；所述bcg_0819c基因上游1000bp片段序列如SEQ ID NO:4所示；
(2)以Pasteur1173P2菌株为模板，以bcg_0819c-dn-HindIII-F/bcg_0819c-dn-NheI-R引物对扩增出bcg_0819c基因下游1000bp片段；所述bcg_0819c-dn-HindIII-F引物序列如SEQ ID NO:5所示，所述bcg_0819c-dn-NheI-R引物序列如SEQ ID NO:6所示；所述bcg_0819c基因下游1000bp片段序列如SEQ ID NO:7所示；
(3)对bcg_0819c基因上游1000bp片段和下游1000bp片段分别采用对应的限制性内切酶进行酶切，回收纯化后的基因片段；所述bcg_0819c基因上游1000bp片段的限制性内切酶为PacI和SpeI；所述bcg_0819c基因下游1000bp片段的限制性内切酶为HindIII和NheI；
(4)将回收后的bcg_0819c基因下游1000bp片段连接至用HindIII和NheI酶切好的pMind-lacZ载体上，转化至DH5α感受态中，挑取转化子并验证，获得重组质粒pMind-lacZ-bcg_0819c-dn1000；
(5)将质粒pMind-lacZ-bcg_0819c-dn1000用PacI和SpeI酶切，再连接回收后的bcg_0819c基因上游1000bp片段，转化至DH5α感受态中，挑取转化子并验证，获得敲除bcg_0819c基因的重组质粒pMind-lacZ-bcg_0819c-updn-2000；
(6)将步骤(5)构建好的质粒pMind-lacZ-bcg_0819c-updn-2000通过电转化法转化到野生型BCG菌株Pasteur1173P2中，在含有OADC和潮霉素抗性的7H10平板上筛选阳性克隆，通过抗生素验证和PCR验证鉴定阳性克隆，获得BCG重组菌株。
3.如权利要求1所述一株新型重组卡介苗菌株在提高卡介苗在动物肺部的停留时间上的应用。
4.如权利要求1所述一株新型重组卡介苗菌株在提高制备结核病疫苗上的应用。
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