[发明专利]基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用

权利要求书

1.鹿科动物的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述靶标核苷酸选自：(1)以SEQ ID NO：7示出的靶标核苷酸；(2)以SEQ ID NO：8示出的靶标核苷酸；或(3)以SEQ ID NO：9示出的靶标核苷酸。

2.权利要求1所述的靶标核苷酸在对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定、或者区分鹿科动物与其近缘物种中的应用；

优选地，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。

3.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的引物对，包括：

(1)Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ ID NO：1)，和Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ ID NO：2)；或者

(2)Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ ID NO：3)，和Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ ID NO：4)。

4.如权利要求3所述的引物对，其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。

5.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求3或4所述的引物对。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：PCR反应试剂和CRISPR/Cas12a体系反应试剂；

优选地，所述PCR反应试剂包含：PCR扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂以及无菌超纯水；

或者优选地，所述CRISPR/Cas12a体系反应试剂包含：基因编辑缓冲液、Cas蛋白、crRNA、无核酸酶水和荧光信号分子；更优选地，所述crRNA为以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。

7.权利要求3或4所述的引物对或权利要求5或6所述的试剂盒在如下方面的应用：鉴定待检测样品中的鹿科动物成分，对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定，区分源自鹿科动物的中药材与其混伪品，或者用于食品、药品或保健品的安全检测。

8.如权利要求7所述的应用，其中，所述待检测样品是鹿科动物、鹿科动物的组织或器官、含有鹿科动物的中药材、或者鹿科动物混伪品；

优选地，所述待检测样品是来自梅花鹿、马鹿或驯鹿的样品；

优选地，所述待检测样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。

9.一种基于时珍法的鹿科动物鉴定方法，包括：

(1)获取包括待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的全基因组序列，构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；

(2)按如下条件中的至少一种，对所述片段序列库中的序列进行筛选，获得全部鹿科动物各自的候选片段序列库：(i)候选序列GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有连续4连以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、3个以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不能与crRNA重复序列互补；(iv)候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％；以及(v)候选序列所在区域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp内不存在连续4个以上的A或GT重复；

(3)将所述待鉴定物种的候选片段序列库与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列进行比对，从所述待鉴定物种的候选片段序列库中筛选出与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述待鉴定物种的候选靶标序列库；

(4)将所述待鉴定物种的候选靶标序列库中的每一条序列在除所述待鉴定物种之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除所述待鉴定物种之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条或多条序列作为特异性靶标序列；

(5)基于所述特异性靶标序列设计引物对，提取待检测样品的基因组DNA并使用所述引物对进行扩增，对扩增产物进行检测，检测到相应的扩增产物时，则所述待检测样品与待鉴定物种具有同一性。

10.如权利要求9所述的鹿科动物鉴定方法，其中，将所述鹿科动物的全基因组序列分别用Jellyfish分成“L-S+1”个长度为S的片段，对每个片段检测以选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM基序的序列，并提取带有PAM基序的序列构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；其中，L＝全基因组序列长度，S＝24-26bp；

优选地，所述crRNA重复序列为以SEQ ID NO：10示出的核苷酸序列；

优选地，所述引物对包括：以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2示出的引物对；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4示出的引物对；或者以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6示出的引物对；

优选地，所述扩增选自PCR扩增、或恒温扩增；

优选地，采用基因编辑对扩增产物进行检测；

优选地，采用CRISPR/Cas12a系统进行所述基因编辑；

优选地，所述CRISPR/Cas12a系统包括以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。