[发明专利]调控关键酶和生长剂Na2

权利要求书

1.一种调控关键酶和生长剂Na₂S促进微藻固碳产油的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)利用基因工程技术，调控真核种类微藻细胞内的ribosomal protein L6、ribosomal protein S2和ribosomal protein L24、Acyl-CoA carboxylase关键酶的表达量，使其分别提高至原始状态的3.2～3.8倍、9.0～10.2倍、5.2～6.2倍和3.0～4.0倍；同时，敲除微藻细胞内的Acyl-CoA oxidase基因；

(2)配制1M浓度的Na₂S水溶液，作为促进生长和光合固碳产油的母液；在通风橱中密封保存，备用；

(3)向琼脂培养基中加入Na₂S水溶液，母液︰培养基的体积比为1:2000～4000；通过对步骤(1)中经过基因改良的微藻细胞进行驯化，选择性地将微藻细胞内的硫氧还蛋白、Rubisco短链、Rubisco长链和酰基辅酶A羧化酶的蛋白含量分别上调至1.20～1.60倍、1.70～1.94倍、1.80～2.40倍、3.00～3.35倍；同时，将微藻细胞内的长链酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶的含量分别下调至30～44％、0～5％；

(4)对驯化后的藻株进行扩大培养生长，培养过程中持续通入烟气，烟气中所含CO₂的体积浓度为5～20％；

(5)培养结束后收获微藻生物质，并测定单位体积藻液的CO₂固定量，以及单位体积藻液的油脂产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，真核种类微藻细胞是微拟球藻、小球藻或雨生红球藻中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，驯化的步骤具体包括：将经过基因改良的微藻细胞接种在含Na₂S水溶液的琼脂培养基上，培养2周至琼脂培养基上长出清晰的藻株群落；从中挑出生长最迅速的藻株，重新接种至新的含Na₂S水溶液的琼脂培养基上，继续培养2周；反复重复前述操作过程，2个月后收集最后一次长出的藻株群落，作为后续扩大培养所需的藻株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，扩大培养的步骤具体包括：将驯化后的藻株接种至装有液体培养基的光反应器内，通入含有CO₂的烟气，进行8～10天的扩大培养；培养期间，控制微藻培养的温度条件为20～25℃，光照条件为40～90μmol·m^-2·s^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，烟气来自于燃煤电厂、煤化工厂或水泥厂的尾气排放系统。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，烟气的通入速率为2～10mL/(min·L)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，测定单位体积藻液的CO₂固定量时，具体包括以下步骤：

a、测量微藻生物质密度：

微藻培养结束后，采集最终藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟；倒掉上清液，加入去离子水冲洗后再离心；如此反复冲洗离心3次，倒掉上清液后置于80℃鼓风干燥箱中烘干24小时至恒重，称量并计算微藻生物质密度DW；

b、测量藻粉生物质中的碳元素含量：

微藻培养结束后，通过离心洗涤和脱水每个样品的微藻悬浮液，收集藻泥；在80°C下干燥72小时后，使用元素分析仪测量藻粉的碳元素含量；

c、计算单位体积藻液的CO₂固定量：

单位体积藻液的CO₂固定量(g/L)＝微藻生物质密度DW(g/L)×藻粉的碳元素含量(％)×44/12。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，采用酯交换法测定单位体积藻液的油脂产量，具体包括以下步骤：

a、微藻培养结束后取样微藻悬浮液，通过离心洗涤和脱水收集藻泥，置于80℃鼓风干燥箱中烘干至恒重；

b、将烘干的固体藻块在研钵中磨成粉末，取0.1g藻粉置于60毫升的消解罐中，依次加入5毫升甲醇、0.2毫升浓硫酸和5毫升氯仿，在鼓风干燥箱中90℃条件下反应4小时；

c、取出消解罐，在空气中冷却；将混合液体离心分层，取下层氯仿层，置于已称好重量的称量瓶中，敞口在鼓风干燥箱60℃条件下烘干至恒重；称量装有油脂的称量瓶，与空瓶时的重量对比求出差值，计算得出藻粉的油脂含量；

d、计算单位体积藻液的油脂产量：单位体积藻液的油脂产量(mg/L)＝微藻生物质密度DW(g/L)×藻粉的油脂含量(mg/g)。