[发明专利]烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和DNA

说明书

本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和DNA，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体具有较高的比酶活和较大的最适温度、最适pH的范围，用于催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，转化率较高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，同时本发明还涉及一种编码上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA以及上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法。

背景技术

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化烟酰胺(Nicotinamide，NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate，PRPP)合成烟酰胺单核苷酸(NMN)，是生物酶法合成NMN重要的酶。而NMN对防治癌症、帕金森病、肥胖、糖尿病及其他衰老相关疾病等有较好的治疗与康复效果。因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。

此外，制备NMN的方法中，生物酶法因无有机溶剂残留且不存在手性问题，成为最环保无公害的高效率生产方法之一，但利用生物酶法生产NMN仍然存在一些限制，例如Nampt催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成NMN，文献报道及数据库中只有来源Homosapiens，Mus musculus和Rattus norvegicus的Nampt被表征，难以满足合成NMN的需求，缺乏可以高效催化合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶。因此，挖掘新来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶便显得很有意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，催化转化率较高。

为达上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

本发明进一步提出了一种编码上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。

本发明还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养12-16h，获得种子液；

制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，当OD₆₀₀值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制温度16-25℃，诱导表达15-23h，然后进行菌体破壁，冷冻离心分离，收集上清液，得到含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的粗酶液。

进一步的，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：

以SEQ ID NO.2的基因为目的基因，以质粒pET-28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒转化到宿主菌株中，得到所述基因工程菌。

进一步的，所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步的，所述TB培养基中含有45-55μg·mL^-1的卡那霉素。

本发明还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于合成烟酰胺单核苷酸的应用。