[发明专利]一种头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取新鲜头颈部鳞癌组织，剪切后分成两份；

(2)取其中一份，加入组织消化液消化，用100μm的滤网过滤，滤过液离心取沉淀，用DMEM完全培养基培养，得到头颈部鳞癌相关成纤维细胞；

(3)取另一份，加入类器官消化液消化，用70μm的滤网过滤，滤过液离心取沉淀，加入红细胞裂解液，混匀，反应，加入清洗液清洗，离心取沉淀，沉淀即为头颈部鳞癌喉癌单细胞；将所得头颈部鳞癌喉癌单细胞与基质胶混匀后，加入改进的类器官培养基培养，得到头颈部鳞癌组织类器官；

(4)将步骤(2)所得头颈部鳞癌相关成纤维细胞和步骤(3)所得头颈部鳞癌组织类器官分别进行消化；Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室；将消化所得头颈部鳞癌相关成纤维细胞接种到上室，消化所得头颈部鳞癌组织类器官接种到下室，加入改进后的类器官培养基进行共培养，即获得所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统。

2.根据权利要求1所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统的构建方法，其特征在于：

所述的改进的类器官培养基的组成如下：含有20ng/ml Wnt-3a，5ng/ml R-spondin1，1×B27Supplement，10mmol/L Nicotinamide，1.25mmol/L N-acetylcsteine，100μg/mlPrimocin，50ng/ml mNoggin，50ng/ml hEGF，100ng/ml hFGF，10nmol/L Gastrin I，500nmol/L A83-01，10.5μmol/LY-27632，10mmol/L HEPES，1×GlutaMAX Supplement的Advanced DMEM/F-12培养基。

3.根据权利要求1所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的组织消化液每份的组成如下：含有25μg/ml CollagenaseⅢ和25μg/ml DNAseⅠ的DMEM培养基；

步骤(2)中所述的加入组织消化液消化的条件为在37±2℃下消化30±5min；

步骤(2)中所述的所述的DMEM完全培养基的组成如下：加1％v/v双抗，10％v/v血清的DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统的构建方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的类器官消化液每份的组成如下：含有10μg/ml Collagenase II、10μg/ml DNAseⅠ和10.5μmol/L Y-27632的advanced DMEM/F12培养基；

步骤(3)中所述的红细胞裂解液为ACK红细胞裂解液；

步骤(3)中所述的清洗液为1mg/ml BSA；

步骤(3)中所述的离心的条件为：4±2℃、300±50g、3±1min；

步骤(3)中所述的基质胶为Matrigel基质胶；

步骤(3)中所述的头颈部鳞癌喉癌单细胞与基质胶的配比为质量比1～1.2:1～1.2；

步骤(3)中所述的培养的条件为37±2℃、相对湿度95±2％的条件下进行培养。

5.根据权利要求1所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与类器官共培养系统的构建方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的Transwell小室为孔径0.4μm的Transwell小室；

步骤(4)中所述的消化的具体操作如下：取步骤(2)所得头颈部鳞癌相关成纤维细胞，加0.25％胰蛋白酶37±2℃消化2±1分钟；取步骤(3)所得头颈部鳞癌相关成纤维细胞，用枪头吹打10±2次，实施物理消化；

步骤(4)中所述的头颈部鳞癌组织类器官细胞的接种量按24孔板每孔接种1～1.2×10⁴个计；

步骤(4)中所述的头颈部鳞癌相关成纤维细胞与头颈部鳞癌组织类器官细胞的个数比为1～1.2:1～1.2；

步骤(4)中所述的共培养的条件为37±2℃、相对湿度95±2％的条件下进行培养。