[发明专利]一种酶标记物的制备方法

说明书

本申请公开了一种酶标记物的制备方法，包括以下步骤：将标记用酶与第一活化剂反应，得到活化后的标记用酶；检测溶液中活化后的标记用酶的实际浓度，作为第一实测浓度；检测溶液中被标记物的实际浓度，作为第二实测浓度；根据第一实测浓度与第二实测浓度，以及酶标记物的需求剂量，确定活化后的标记用酶和被标记物反应的剂量；将上述确定剂量的活化后的标记用酶与被标记物偶联，终止偶联反应后制得酶标记物。本申请提供的方法，通过对标记用酶、被标记物实际浓度的测定，并根据实际浓度固定摩尔比例的方法，控制标记用酶与被标记物偶联比例，达到改善酶标记物批间差的效果。

技术领域

本申请涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种酶标记物的制备方法。

背景技术

EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种零长度偶联剂。EDC能让羧酸(-COOH)与氨基(-NH₂)直接共轭，而本身不成为目标分子之间最终酰胺键偶联的一部分。碱性磷酸酶上含有氨基基团和羧基基团，抗体、抗原或者偶联了BSA等大分子的抗原(以下简称抗原-BSA)等被标记物上也含有氨基。碱性磷酸酶上的羧基基团和EDC反应生成o-酰基异脲中间体，中间体很容易被氨基酸基团的取代，抗体、抗原或抗原-BSA等被标记物上的氨基基团与o-酰基异脲中间体上的原始羧基形成酰胺键，从而实现了碱性磷酸酶与抗体、抗原、抗原-BSA等结合物的偶联。另外，因o-酰基异脲中间体不稳定，易水解，故通常在EDC偶联过程中添加NHS或Sulfo-NHS，加入后可显著提高活性中间体的溶解性和稳定性。

HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体一般有两种方法，戊二醛偶联方法和过碘酸盐氧化法。其中，过碘酸盐氧化法的原理：过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化成醛基，醛基与抗体上的氨基形成Schiff碱而结合，结合物可进一步用NaBH₄或乙醇胺还原生成稳定的酶标记物。戊二醛偶联方法的原理：戊二醛是带有两个醛基活性基团同双功能偶联剂，两个醛基分别与抗体和碱性磷酸酶上氨基基团形成Schiff碱，将两分子以五碳桥连接起来，结合物可进一步用NaBH₄或乙醇胺还原生成稳定的酶标记物。Sulfo-SMCC是水溶性的氨基-巯基异性双功能偶联剂，两端分别包含了Sulfo-NHS酯和马来酰亚氨基反应基团。NHS酯能够在适当条件下与伯胺基发生反应，形成稳定的酰胺键；而马来酰亚氨基反应基团能够在适当条件下与巯基发生反应，形成稳定的硫醚键。Traut’s Reagent可以将带有氨基基团的物质通过开环反应引入末端巯基。另外，二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原试剂也可以通过还原作用将带有氨基基团的物质还原成巯基。

碱性磷酸酶上含有氨基基团，抗体等结合物上也含有氨基，故可通过Sulfo-SMCC上的Sulfo-NHS酯基团与碱性磷酸酶或被标记物上的氨基基团反应，Sulfo-SMCC上的另一端马来酰亚氨基反应基团则可与经过Traut’s Reagent开环引入的带有巯基基团的被标记物或碱性磷酸酶反应，从而形成经过Sulfo-SMCC偶联的碱性磷酸酶标记物。

上述偶联方法中包括了多个化学反应过程，例如NHS酯基团与氨基基团的反应、Traut’s Reagent与氨基反应、马来酰亚氨基反应基团与巯基反应等，较为复杂。从目前的生产实践发现，不同批次生产的标记用酶标记被标记物批间差异大，导致后续的检测结果偏差增大、准确性降低。为了减少批间差异，需要在每次更换时都进行验证，工作量大、效率低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的第一个目的为提供一种酶标记物的制备方法；本申请提供的方法，通过对标记用酶、被标记物实际浓度的测定，并根据实际浓度固定摩尔比例的方法，控制标记用酶与被标记物偶联比例，达到改善酶标记物批间差的效果。

本发明提供的技术方案如下：

一种酶标记物的制备方法，包括以下步骤：

将标记用酶与第一活化剂反应，得到活化后的标记用酶；

检测溶液中活化后的标记用酶的实际浓度，作为第一实测浓度；